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酵母组蛋白H3K79L、H4K20L单突变及双突变对Elp3功能和SSA3等表达的影响

作　者: 孔艳
导　师: 李芬
学　校: 河南师范大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 表观遗传修饰 组蛋白突变 Elongator复合物 ELP3 功能补偿 基因表达
分类号: Q75
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的：组蛋白修饰在基因表达调控等多种生物学过程中起着重要作用,是表观遗传中重要的调控机制之一。组蛋白乙酰化、甲基化等修饰对基因表达调控具有重要影响。现有研究结果显示,酵母Elongator复合物是由6个亚基组成,作为具有组蛋白乙酰基转移酶活性的复合体协助高度磷酸化的RNA聚合酶Ⅱ参与SSA3, GAL1等基因的转录延伸过程。在体外去除HeLa细胞抽提物中的Elongator复合物可降低其转录染色质模板的速率,也为人Elongator复合物参与转录延伸提供了生化证据。已知酵母和人Elongator复合物组成高度保守,且功能极为相似,其催化亚基Elp3 C端的保守HAT活性核心,为Elongator行使功能所必需。生物信息学分析表明Elp3的N末端还有一个类似S-腺苷甲硫氨酸激酶的结构域,该结构域包含Fe4S4簇,可结合S-腺苷甲硫氨酸,可能与甲基化反应有关,因而推测这个未知功能的催化结构域可能拥有组蛋白去甲基酶活性。Greenwood等研究表明Elongator无组蛋白去甲基化酶活性,其Elp3 N端的FeS簇为Elongator保持结构完整性所必需。因此目前Elp3第二结构域的功能尚不清楚。组蛋白特定位点的乙酰化、甲基化修饰对细胞的生长和基因的转录有重要影响。为研究组蛋白甲基化与Elp3功能和特定基因表达的关系,本文构建了酵母组蛋白H3K79或/和H4K20突变为亮氨酸并伴随Elp3缺失的三个突变菌株,运用酵母功能互补实验以及基因表达分析体系以研究在基因组水平甲基化的改变对全长和第二结构域缺失的酵母和人ELP3补偿功能的影响,以便深入了解Elp3功能及其与组蛋白乙酰化、甲基化的关系。方法：运用定点突变技术获得组蛋白特定甲基化位点(H3K79, H4K20)氨基酸突变的着丝粒型载体；通过Plasmid Shuffle实验用突变组蛋白取代野生组蛋白得到的组蛋白H3/H4特定甲基化位点突变并伴随酵母ELP3基因缺失的系列突变菌株；运用乙酸锂转化法将Elp3系列质粒转入系列组蛋白突变并伴随ELP3缺失的突变株；通过高温、高盐、咖啡因等敏感性实验和SSA3、GAL1等基因表达的检测,确定基因组水平甲基化位点突变对ELP3补偿功能和SSA3、GAL1等基因表达的影响。结果：1、利用定点突变技术构建组蛋白特定甲基化位点(H3K79,H4K20)氨基酸突变的着丝粒型载体。2、运用Plasmid Shuffle技术获得组蛋白的H3K79、H4K20单突变和双突变为亮氨酸的elp3△菌株。3、转入全长和第二结构域缺失的酵母和人ELP3至组蛋白突变elp3△菌株作功能互补和基因表达分析,结果表明特定组蛋白甲基化位点突变严重影响了hELP3对elp3△菌株生长缺陷和SSA3和GAL1延迟表达的补偿功能,并使yELP3的补偿功能明显降低；第二结构域缺失的酵母和人ELP3几乎无补偿功能。4、在供试的各种条件下,转入yELP3基因的H3K79单突变elp3△菌株生长不如H4K20单突变elp3△菌株,而H4K20单突变elp3△菌株生长不如H3K79/H4K20双突变elp3△菌株。结论：1、组蛋白H3K79,H4K20突变为亮氨酸不同程度降低了酵母和人ELP3对elp3△菌株生长缺陷和SSA3、GAL1表达延迟缺陷的补偿功能。组蛋白双突变情况下,转入完整及第二结构域缺失的酵母和人ELP3各转化株之间的生长差异不如对应的单突变株之间的差异明显。但各组蛋白突变均未使elp3△菌株产生比组蛋白野生elp3△菌株更为严重的缺陷表型,表明Elp3可能与H3K79,H4K20的甲基化状态并无直接关系。2、组蛋白H3K79单突变elp3△菌株产生比组蛋白H4K20单突变elp3△菌株更为严重的生长缺陷,H4K20突变elp3△菌株生长不如H3K79/H4K20双突变株。表明组蛋白不同位点的甲基化修饰对细胞生长影响不同,组蛋白H3K79和H4K20维持一定的甲基化水平对酵母细胞的正常生长尤其重要,在不利条件的快速适应方面H3K79的甲基化平衡可能比H4K20更为重要。3、缺失Elp3第二催化结构域的酵母及人ELP3几乎不能补偿H3K79,H4K20突变elp3△菌株的生长缺陷及SSA3、GAL1表达延迟缺陷,表明第二结构域为Elp3行使功能所必需。

全文目录


摘要  3-5ABSTRACT  5-8目录  8-11缩略语  11-121 引言  12-30  1.1 表观遗传学的概念和基因调控分子机制  12-15    1.1.1 表观遗传学的概念  12-13    1.1.2 表观遗传学的基因调控分子机制  13-15  1.2 表观遗传修饰相关酶  15-21    1.2.1 组蛋白乙酰转移酶的种类  15    1.2.2 组蛋白去乙酰化酶的种类  15-16    1.2.3 组蛋白乙酰化/去乙酰化与基因表达调控  16    1.2.4 组蛋白甲基转移酶  16-17    1.2.5 组蛋白去甲基化酶  17-21  1.3 表观遗传学与相关疾病  21-26    1.3.1 表观遗传修饰酶与疾病发生  22-24    1.3.2 表观修饰酶抑制剂与相关疾病的治疗机理和策略  24-26    1.3.3 问题和展望  26  1.4 Elongator复合物研究进展  26-29    1.4.1 Elongator复合物的发现  26-27    1.4.2 Elongator复合物的组成  27    1.4.3 Elongator复合物的功能  27-29  1.5 本文的研究目的和意义  29-302 材料与方法  30-40  2.1 实验材料  30-34    2.1.1 菌株和质粒  30    2.1.2 引物设计  30-31    2.1.3 试剂和培养基  31-33    2.1.4 酶和试剂盒  33    2.1.5 主要仪器设备  33-34  2.2 实验方法  34-40    2.2.1 载体的构建  34-35    2.2.2 琼脂糖凝胶电泳  35    2.2.3 PCR胶回收产物的纯化  35    2.2.4 Dpn Ⅰ限制性内切酶的消化  35    2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化  35    2.2.6 载体的鉴定  35    2.2.7 酵母转化  35-36    2.2.8 运用Plasmid Shuffle实验获得突变菌株  36    2.2.9 功能互补实验  36    2.2.10 酵母RNA的提取  36    2.2.11 基因表达分析  36-403 实验结果  40-56  3.1 载体的构建  40-41    3.1.1 酵母组蛋白hhf1 79K-HHT1载体的获得  40    3.1.2 酵母组蛋白HHF1-hht1 20K载体的获得  40    3.1.3 酵母组蛋白hhf1 79K-hht1 20K载体的获得  40-41  3.2 含酵母组蛋白H3/H4点突变的表达载体的鉴定  41-43    3.2.1 载体pRS313:hhf1 79K-HHT1的鉴定  41    3.2.2 载体pRS313:HHF1-hht1 20K的鉴定  41-42    3.2.3 载体hhf1 79K-hht1 20K的鉴定  42-43  3.3 运用Plasmid Shuffle实验获得所需要的突变菌株  43-44  3.4 敏感性实验结果  44-49    3.4.1 含H3/H4 K突变为L的elp3△菌株表型的比较  44-45    3.4.2 酵母和人ELP3转入含H3/H4 K突变为L的elp3△菌株的功能互补实验  45-49  3.5 组蛋白H3/H4特定位点赖氨酸突变的elp3△菌株的基因表达分析  49-56    3.5.1 组蛋白H3/H4特定位点赖氨酸突变的elp3△菌株对SSA3基因表达的影响  49-52    3.5.2 组蛋白H3/H4特定位点赖氨酸突变的elp3△菌株对GAL1基因表达的影响  52-564 讨论  56-62  4.1 实验方法的选择和依据  56-57  4.2 组蛋白H3K79/H4K20点突变对酵母Elp3补偿功能的影响  57-58  4.3 组蛋白H3K79/H4K20点突变对人Elp3补偿功能的影响  58  4.4 组蛋白H3K79/H4K20点突变对基因表达的影响  58-59  4.5 ELP3第二催化结构域功能探讨  59-62结论  62-64参考文献  64-70致谢  70-72攻读学位论文期间发表的研究论文目录  72-74

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 分子遗传学
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