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优质棉纤维发育品质相关基因的分离、克隆、鉴定与定位

作　者: 贺亚军
导　师: 张天真
学　校: 南京农业大学
专　业: 生物技术
关键词: 棉花 EST 基因芯片谷氨酰胺合成酶脂肪酶木聚糖水解酶小分子质量热激蛋白
分类号: S562
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

棉花是世界重要的经济作物之一。棉纤维是棉子上的一种表皮毛,也是重要的经济价值之所在,是纺织工业的原料。优良的纤维品质是世界棉花育种的主要目标之一。因此,从分子水平阐明棉纤维发育的机理,具有重要的理论价值与现实意义。本研究的目的即利用基因芯片方法筛选与棉纤维品质相关的EST,并分离和鉴定部分棉纤维发育相关基因,这些研究将有助于我们进一步探讨形成优质纤维的分子机理。构建高强纤维种质系7235开花后5-25天棉纤维伸长、次生壁加厚期间的cDNA文库,随机大规模测序,获得1436条EST,制成基因芯片。提取7235和纤维品质一般的陆地棉遗传标准系TM-1不同发育时期的mRNA与之杂交,筛选到31条差异表达EST,主要是参与代谢、次级代谢、胁迫与抗逆、转录等相关基因。通过RT-PCR验证,23条差异表达EST与基因芯片实验结果一致。为了进一步定位这些差异表达EST并分析其与纤维品质性状的相关性,我们分析了所有差异表达EST在7235与TM-1间的多态性。结果表明,三条EST在7235与TM-1间存在多态。利用(7235×TM-1)RIL群体,对这三条EST进行染色体定位及单标记分析,结果表明,两条EST(分别编码LTP基因与ADH基因)与纤维品质性状极显著相关。由于大部分基因在7235与TM-1间不存在差异,所以,我们利用[(TM-1×Hai 7124)×TM-1]群体对其进行定位。结果表明,13条差异表达EST被定位到四倍体棉花遗传图谱的相应染色体上,其中8条EST定位在品质相关QTL区间或附近。通过基因芯片技术,我们鉴定了一条可能编码谷氨酰胺合成酶的EST。Northern杂交验证了该基因在7235与TM-1开花后8天的胚珠和纤维中表达有显著差异。随后,利用7235纤维cDNA文库测序,结合5′RACE技术从7235纤维中获得了全长谷氨酰胺合成酶基因。序列分析结果表明,该基因与已报道的其他植物的细胞质谷氨酰胺合成酶(GS1)基因具有较高氨基酸序列同源性,命名为GhGS。Southern blot分析结果表明,GhGS在陆地棉基因组的A、D亚基因组可能各存在一个拷贝。之后,从不同材料7235、TM-1、非洲棉、雷蒙德氏棉基因组中分离到GhGS基因序列。根据7235与TM-1基因组GhGS序列的SNP,将该基因在(7235×TM-1)RIL群体中进行定位并分析基因与纤维表型的相关性,结果发现,GhGS与纤维强度存在相关,但由于该RIL图谱上的位点较少,GhGS基因不能整合到该图谱上。随后,利用[(TM-1×Hai 7124)×TM-1]群体,将GhGS基因定位在四倍体棉花遗传图谱的D7染色体上。另外,我们测定了棉纤维发育不同时期胚珠和纤维的GS活力和总蛋白含量。测定结果表明,在开花后5天和8天的7235胚珠GS活力显著高于TM-1相应时期的胚珠GS活力。同时发现,开花后11天的7235胚珠总蛋白含量和胚珠重量都显著高于同时期TM-1胚珠总蛋白含量和重量。这一结果暗示GS可能通过提供N而促使棉花种子的形成。而在纤维中的测定结果表明,在7235中GS活力和总蛋白含量都低于TM-1中的GS活力和总蛋白含量。这一结果暗示GS在胚珠和纤维中行使的功能可能并不完全相同。GS在纤维发育过程中的可能功能还需进一步探讨。另一个克隆的基因为脂肪酶基因。通过对7235纤维cDNA文库测序,获得一个可能编码脂肪酶的cDNA片段。随后,利用RACE技术获得该cDNA全长并命名为GhLipase。序列分析结果表明,GhLipase全长1286bp,包含一个编码368个氨基酸的开放读码框。BLAST分析表明,它与已报道的其他植物的脂肪酶基因具有较高的氨基酸序列同源性。从表达特征看,GhLipase在胚珠和纤维细胞优势表达,而且在开花后5-17天的纤维中表达水平较高。Southern blot结果表明,GhLipase基因在陆地棉基因组中可能存在两个拷贝。将该基因定位在四倍体棉花遗传图谱的A13染色体上。第三个利用7235cDNA文库分离的基因为木聚糖水解酶基因。该cDNA全长1790bp,ORF编码560个氨基酸。CDS分析表明,GhXyl基因推导的氨基酸含有糖基水解酶家族10的保守区域,具有典型的糖基水解酶家族10基因结构,BLAST结果表明其与来源于其他植物的木聚糖水解酶有较高的同源性,命名为GhXyl基因。RT-PCR和Northern blot分析结果表明,GhXyl属纤维细胞优势表达,且在开花后5-8天的纤维中表达水平最高。Southern杂交结果表明木聚糖水解酶基因在陆地棉基因组中存在两个拷贝。将该基因定位在四倍体棉花遗传图谱的A3染色体上。本研究利用7235纤维cDNA文库,还分离到六个小分子质量的热激蛋白基因,分别命名为LMWHSP1、LMWHSP2、LMWHSP3、LMWHSP4、LMWHSP5、LMWHSP6。分析它们的序列结构,发现它们分别属于三种不同类型的小热激蛋白,LMWHSP1、LMWHSP2、LMWHSP4、LMWHSP6都与细胞质Ⅰ类热激蛋白序列同源性较高,而LMWHSP3与细胞质Ⅱ类热激蛋白序列同源性较高,LMWHSP5与线粒体热激蛋白序列同源性较高。对这六个小分子质量热激蛋白基因进行转录表达分析,结果表明,它们在棉花体内具有不同的表达特征,LMWHSP2是组成型表达的基因,LMWHSP 1、LMWHSP 4、LMWHSP5、LMWHSP6都在开花当天的胚珠中表达量最高,而LMWHSP3在棉花叶片中优势表达。这一结果暗示,线粒体小热激蛋白和细胞质Ⅰ类小热激蛋白基因可能受纤维启始和分化的调控,而细胞质Ⅱ类小热激蛋白与棉花叶片的生长发育相关。利用本实验室的四倍体棉花遗传图谱,对这六个小热激蛋白基因进行定位,其中三个基因LMWHSP1、LMWHSP2、LMWHSP3分别被定位在A4、D8和A6染色体上。

优质棉纤维发育品质相关基因的分离、克隆、鉴定与定位

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