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PDK1 siRNA及UCN-01对食管癌EC9706细胞PDK1基因表达影响的研究

作　者: 于婧
导　师: 陈奎生
学　校: 郑州大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 食管癌EC9706细胞 PDK1 RNA干扰 UCN-01 增殖 凋亡
分类号: R735.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


我国食管癌发病率位居世界首位,开发新型药物、分子靶向治疗食管癌成为研究的热点。3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(3-phosphoinositide-dependent protein kinase 1, PDK1)属于AGC激酶家族,其介导调节的PI3K/Akt信号转导通路异常与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关。PDK1是Akt、p70-S6K、RSK、PKC等AGC激酶活化环的主要上游激酶,作为Akt上游激酶,1997年被Alessi DR等分离鉴定,可以磷酸化Akt的Thr308位点使其激活,活化的Akt调节其下游的多条路径,继而影响糖类代谢、蛋白转录翻译、细胞增殖、迁移以及抗凋亡。PDK1可能成为当前肿瘤治疗研究中新的靶点。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是一种转录后的基因沉默现象,具有高效、高特异性等优点,已经被广泛应用于基因功能鉴定、基因表达转录后调控等研究领域,同时也为多种疾病特别是恶性肿瘤的基因治疗开拓了新的思路。UCN-01(7-hydroxy staurosporine)是目前已有的文献报道中研究较成熟的PDK1抑制剂,是星孢菌素(staurosporine)的7α羟基衍生物。UCN-01能通过竞争性抑制PDK1的ATP结合位点而抑制其激酶活性,从而使下游Akt磷酸化水平下降,干扰下游信号转导进而影响细胞代谢、增殖和凋亡,引起细胞毒作用。本研究采用PDK1 siRNA及其抑制剂UCN-01沉默食管癌EC9706细胞中PDK1基因,阻断PI3K/Akt信号转导通路,观察下游Akt蛋白磷酸化水平的变化,及其对细胞增殖、凋亡的影响,为寻求食管癌的分子靶向治疗途径提供实验依据。材料和方法1.高分化人食管鳞癌EC9706细胞株于37℃、5%CO2孵育箱中培养,以RNAi-Mate转染试剂介导PDK1 siRNA转染细胞,或以50nM、100nM、200nM浓度的UCN-01分别作用于细胞24h、48h、72h。2.采用RT-PCR技术检测各组细胞中PDK1 mRNA的表达。3.采用Western Blot技术及免疫细胞化学法检测各组细胞中PDK1、Akt p-Akt的蛋白表达。4.采用MTT法检测各组细胞生长抑制率。5.采用TUNEL及流式细胞术检测各组细胞凋亡的变化情况。6.统计学处理：应用统计软件SPSS13.0分析实验数据,检验水准a=0.05。结果1. siRNA转染效率检验：不同浓度Negative control FAM-siRNA转染EC9706细胞,6h后在荧光显微镜下观察,浓度100nM组转染效率最高,后续siRNA转染实验均采用此浓度。2. PDK1 siRNA的筛选：与细胞对照组相比,Negative control siRNA组和RNAi-Mate组对PDK1 mRNA表达没有影响,且二者之间无明显差异(P>0.05)。三条PDK1 siRNA转染EC9706细胞的PDK1 mRNA水平均低于细胞对照组(P<0.05),其中PDK1 siRNA1抑制效率最高(P<0.05),筛选出PDK1 siRNAl序列进行后续试验。3. PDK1 siRNA、UCN-01对PDKl mRNA表达的影响：PDK1 siRNA1转染EC9706细胞可下调PDK1 mRNA表达,以转染72h较显著(P<0.05); UCN-01也能够下调EC9706细胞PDKl mRNA表达,且具有浓度依赖性和作用时间依赖性(P<0.05); PDK1 siRNA1下调细胞PDK1mRNA表达的能力强于浓度200nM的UCN-01(P<0.05)。4. PDK1 siRNA、UCN-01对PDK1蛋白表达及Akt磷酸化水平的影响：PDK1siRNA1可下调PDK1、p-Akt蛋白表达,以转染72h较显著(P<0.05); UCN-01也能够下调细胞PDK1、p-Akt蛋白表达,且具有浓度依赖性和作用时间依赖性(P<0.05); PDK1 siRNAl下调细胞PDK1、p-Akt蛋白表达的能力比浓度200nM的UCN-01强(P<0.05); PDK1 siRNA、UCN-01对于Akt蛋白表达的影响无统计学差异(P>0.05)。5. PDK1 siRNA、UCN-01对EC9706细胞增殖的影响：与各对照组相比,PDK1 siRNA、UCN-01可提高细胞生长抑制率,且具有时间依赖性(P<0.05)；UCN-01对生长抑制率的影响还具有浓度依赖性(P<0.05); PDK1 siRNA对细胞生长抑制率的影响强于浓度200nM的UCN-01(P<0.05)。6. PDK1 siRNA、UCN-01对EC9706细胞凋亡的影响：PDK1 siRNA、UCN-01作用于EC9706细胞72h后早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞比例增加(P<0.05)；UCN-01对EC9706细胞凋亡的影响具有浓度依赖性(P<0.05); PDK1 siRNA1促进EC9706细胞凋亡的能力比浓度200nM的UCN-01更强(P<0.05)。结论1. PDK1 siRNA能有效沉默EC9706细胞PDK1基因的表达,下调其下游Akt蛋白磷酸化水平,从而阻断PI3K/PDK1/Akt信号转导通路,抑制EC9706细胞增殖,诱导细胞凋亡,表明PDK1可能是食管癌分子治疗的有效靶点2.PDK1化学抑制剂UCN-01能够抑制EC9706细胞PDK1基因表达及Akt蛋白磷酸化,阻断PI3K/PDK1/Akt信号转导通路,抑制细胞增殖及诱导其凋亡,这可能是UCN-01发挥抗肿瘤作用的重要机制之一,UCN-01有望成为新型肿瘤靶向治疗药物。

全文目录


摘要  4-7
Abstract  7-14
英文缩写索引  14-15
1 引言  15-17
2 材料和方法  17-30
  2.1 实验材料  17-20
    2.1.1 细胞系  17
    2.1.2 主要试剂  17-18
    2.1.3 主要实验仪器  18-19
    2.1.4 主要试剂的配置  19-20
  2.2 实验方法  20-28
    2.2.1 EC9706细胞的培养  20-21
    2.2.2 UCN-01的配置  21-22
    2.2.3 siRNA转染EC9706细胞  22
    2.2.4 RT-PCR检测mRNA表达  22-23
    2.2.5 细胞爬片的制备  23-24
    2.2.6 免疫细胞化学法  24-25
    2.2.7 Western Blot检测蛋白表达  25-27
    2.2.8 四唑盐(MTT)比色法检测细胞增殖  27
    2.2.9 原位末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡  27-28
    2.2.10 流式细胞术检测细胞凋亡  28
  2.3 统计学处理  28-30
3 结果  30-40
  3.1 siRNA转染效率检验  30
  3.2 PDK1 siRNA的筛选  30
  3.3 PDK1 siRNA、UCN-01对PDK1mRNA表达的影响  30-32
  3.4 PDK1 siRNA、UCN-01对PDK1蛋白表达及Akt蛋白磷酸化水平的影响  32-36
    3.4.1 免疫细胞化学结果  32-33
    3.4.2 Western Blot结果  33-36
  3.5 PDK1 siRNA、UCN-01对EC9706细胞增殖的影响  36-37
  3.6 PDK1 siRNA、UCN-01对EC9706细胞凋亡的影响  37-40
    3.6.1 原位末端标记法(TUNEL)结果  37-38
    3.6.2 流式细胞术结果  38-40
4 讨论  40-47
  4.1 PDK1与肿瘤的关系  40-41
  4.2 PDK1 siRNA对EC9706细胞PDK1基因表达的影响  41-42
  4.3 UCN-01对EC9706细胞PDK1基因表达的影响  42-43
  4.4 PDK1 siRNA、UCN-01对Akt蛋白磷酸化水平的影响  43-44
  4.5 PDK1 siRNA、UCN-01对EC9706细胞增殖的影响  44-45
  4.6 PDK1 siRNA、UCN-01对EC9706细胞凋亡的影响  45
  4.7 结语  45-47
5 结论  47-48
附图  48-54
参考文献  54-59
综述部分 PDK1基因与肿瘤靶向治疗的研究进展  59-76
  1 PDK1基因和蛋白的分子结构  60
  2 PDK1与AGC激酶家族及其生物学功能  60-63
    2.1 PDK1介导的PI3K/Akt信号转导通路  60-62
    2.2 PDK1对p70-S6K的调节  62
    2.3 PDK1对PKC的调节  62-63
    2.4 PDK1缺失的小鼠  63
  3 PDK1激酶活性的调节  63-65
    3.1 磷酸化调节  64
    3.2 胞内定位调节  64-65
    3.3 结合蛋白的作用  65
  4 PDK1与肿瘤  65-67
    4.1 PDK1与乳腺癌  66
    4.2 PDK1与胶质母细胞瘤  66-67
    4.3 PDK1与结肠癌  67
  5 靶向沉默PDK1基因的策略  67-69
    5.1 以PDK1为靶点的基因治疗  67-68
    5.2 PDK1抑制剂的开发及其在肿瘤治疗中的应用  68-69
  6 小结与展望  69-71
  参考文献  71-76
附录部分  76-77
  致谢  76-77
  个人简历  77

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 食管肿瘤
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