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解脲脲原体感染在类风湿关节炎发病机制中的作用研究

作　者: 付敏
导　师: 张源潮
学　校: 山东大学
专　业: 内科学
关键词: 关节炎，类风湿解脲脲原体支原体感染细胞因子
分类号: R593.22
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

研究背景和目的类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种累及多关节的慢性炎症性疾病,晚期严重影响生活质量,致残率很高。滑膜细胞增殖和炎症细胞因子紊乱为其主要特点。该疾病病因不清、机制未明,要想做到更好的第二级预防甚或第一级预防是不可能实现的,只有明确该疾病的诱因,才能做到二级或一级预防,以更好地指导医患参与到该疾病的防治。遗传因素诱因中的共同位点学说提出曾被作为一个重要的致病机制研究。P Stastny发现60%-80%的白种人RA患者携带HLA-DR4基因单倍型,而对照组为20%-25%。但是迄今为止仍未找到这种特异性抗原。而且,一些正常人也表达DR4等位基因而不发病,说明在RA的发病过程中,遗传因素约占病因的35%不是单一的致病因素,还有其他因素的参与。既往研究者的精力大多集中在炎症细胞如巨噬细胞、中性粒细胞、T细胞、B细胞及由其主要分泌的细胞因子TNF-α和IL-1,针对这些细胞因子的单克隆抗体Adalimumab和Infliximab及可溶性受体拮抗剂Eternacept被陆续用于临床,虽在初期取得了较为理想的效果。然而,经过10余年的临床用药,越来越多的临床医生发现应用上述生物制剂,达到美国风湿病学会(ACR)20缓解的患者不超过60%,研究者不得不重新思考除炎症细胞及细胞因子外,是否还存在一个在其上游起始动作用的因素。支原体是缺乏细胞壁的最小的原核型微生物,无脂多糖、肽聚糖和脂磷壁酸等胞壁成分。目前普遍认为支原体的致病性主要来自其细胞膜表面的脂质相关膜蛋白(lipid associated membrane proteins, LAMPs),主要成分是脂蛋白,具有良好的抗原性,可激发宿主细胞免疫应答,并能跟宿主细胞发生相互作用。支原体感染宿主细胞的结局依赖于支原体和宿主细胞两方面的特性。Hall等报道发酵支原体(Mycoplasma fermentans, Mf)的重组蛋白P48诱导白血病细胞分化和凋亡。Into等证明Mf和唾液支原体的LAMPs诱导Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)2介导的淋巴细胞和单核细胞凋亡。Zeng Y等研究发现穿透支原体LAMPs可通过NF-κB途径诱导巨噬细胞凋亡。而另一些报道认为支原体感染能抑制细胞凋亡。曾有人提出支原体与肿瘤也有密切相关。已发现多种支原体(包括Uu)与人类存在共同抗原。最新的48000点DNA基因表达芯片研究显示,受支原体感染后的细胞在细胞周期、信号传达、凋亡、蛋白质合成、新陈代谢、钙离子通道等诸多方面表现为上调或下调。即支原体可干扰免疫和细胞的功能已被证实。这些矛盾的结果可能是由于不同的支原体或其蛋白对不同细胞系的作用效果不同造成的。RA等结缔组织病与支原体感染深入研究,国内外尚无定论。Stuckey等临床发现一10岁男性患者在患有先天性无丙种球蛋白血症患者同时患有多关节炎,并在滑膜穿刺物培养出Uu,得出结论,Uu可能会诱发多关节炎。Schaeverbeke T等通过PCR和培养方法检测27例RA患者的滑膜组织,有5例支原体阳性,其中有1例是Uu,较骨性关节炎(OA)、痛风关节炎(GA)、银屑病性关节炎、损伤后关节炎、关节积血等阳性率高,提示炎症性关节炎,尤其是RA可能与支原体感染有关。SheenaM等通过套式PCR方法对24例RA患者中的19例进行检测发现有支原体感染,较OA、创伤后骨关节炎、正常对照组阳性率高。陆亚华检测RA患者Uu的阳性率,36例RA患者泌尿道拭子Uu阳性率为30.8%,26例RA患者关节液Uu阳性率为7.7%,均较对照组OA等高,但与国外结果不同的是未检测到Mfo朱琦等研究55例RA患者泌尿生殖系统,Uu阳性率54.5%,较对照组差异有统计学意义。本研究搜集国内外病例对照研究文献对支原体在RA和各对照组间的感染率,来明确支原体与RA的相关性。对临床上收集的资料齐全的RA伴Uu感染患者和RA不伴Uu感染患者的一般情况、临床指标、影像学指标进行比较,探讨Uu感染RA患者的血清抗体学、影像学指标特点和非特异性炎症指标的特点,从而我们推测Uu可能在RA发病中起作用。在RA滑膜的病理切片中就显示滑膜成纤维细胞(synovial fibroblasts,SFs)的高度增殖,既往SFs在RA被认为是一种被动的增殖状态,以一种“受害者”的身分出现。随着生物制剂在疗效上不足问题的出现,SFs作为RA“始动者”也越来越受到关注。滑膜细胞中另一重要组成成分滑膜巨噬细胞浸润并释放大量炎症细胞因子是RA滑膜病理的另一特征。这两种细胞通常被认为是RA病理损伤的靶细胞。为进一步探讨Uu在RA发病中的作用机制,本研究将通过测定UuLAMPs对滑膜成纤维细胞增殖的影响和对THP-1巨噬细胞释放细胞因子的影响来探讨UuLAMPs对滑膜细胞的作用,从而反映UuLAMPs在RA中的作用机制。滑膜巨噬细胞在体外培养后不易存活,所以使用人单核细胞系THP-1经佛波酯(PMA)诱导产生的THP-1巨噬细胞作为滑膜巨噬细胞的细胞模型。UuLAMPs是一组蛋白,而一直以来却通常被作为一个整体来研究,只有小部分研究将其中某个蛋白片段作单体研究。Liu W等和Gong M等分别研究发现猪鼻支原体的一种膜脂蛋白p37作用于哺乳动物细胞可以诱其恶变并增强肿瘤细胞的侵袭和转移能力。本研究为探讨可能在RA发病中起作用的蛋白片段,将采用SDS-PAGE分离蛋白,检测初诊初治RA及对照组人血清中的抗UuLAMPs片段IgM和IgG抗体,从而找出UuLAMPs,总蛋白中具有强免疫原性的蛋白片段,并筛选出可能在RA发病中起作用的蛋白片段。研究对象与方法第一部分探讨支原体感染与RA的相关性。以mycoplasma或ureaplasma、arthritis, rheumatoid,限定词为：human、English检索英文文献,以支原体或脲原体、类风湿关节炎检索中文文献,收集研究支原体感染与RA相关性的病例对照研究试验。由两位研究者独立纳入试验、提取数据和评价质量,对所纳入的试验进行系统评价。应用RevMan 4.3.2软件进行分析,计算并采用比值比(OR)作为疗效分析的统计量,并以95%可信区间(CI)表示。分析前先进行异质性检验,若无异质性,应用固定效应模型进行分析,若存在异质性,应用随机效应模型进行分析。排除纳入研究中与其他实验特征不同的试验,考察对其异质性的影响,本研究中这些特征包括研究年限、实验方法、病例数大小等。发表偏倚采用漏斗图分析。第二部分临床病例资料分析,研究Uu感染RA患者的临床特征。收集我院RA患者病例74例,通过培养法对宫颈或尿道分泌物行Uu检测,根据Uu是否感染将RA患者分为Uu阳性RA组和Uu阴性RA组。收集并分析两组患者年龄、病程、血清抗体指标、血沉(ESR)、C反应蛋白(CRP)、活动指数(Disease Activity Score in 28 joints, DAS28)、影像学检查,并进行统计学分析。第三部分液体培养基培养Uu,提取UuLAMPs,研究UuLAMPs对RASFs和PMA诱导的THP-1巨噬细胞的影响。MTT法检测RASFs的增殖,RT-PCR和ELISA法检测mRNA和蛋白水平的TNF-a和IL-1β。为进一步研究UuLAMPs中具有强免疫原性的蛋白片段,收集Uu阳性患者17例,ReA患者18例,RA伴Uu阳性患者16例,RA不伴Uu阳性患者17例,Uu阴性健康志愿者22例。将UuLAMPs行聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(SDS-PAGE)分析,每次样本跑两板胶,一板胶考马斯亮蓝R250染色,另一板胶行Western blot测定,以UuLAMPs为抗原,患者及对照组血清为一抗,兔抗人IgG、羊抗人IgM为二抗,筛选出具有免疫原性的蛋白片段,并筛选出可能在RA发病中起作用的蛋白片段。结果1、Meta分析显示RA与支原体感染存在相关性,其中RA与非RA组的支原体感染率差异有统计学意义OR=4.40,95%CI(2.26,8.56),P<0.0001,按照检测方法和发表时间不同进行敏感性分析的结果无差异。RA与骨关节炎(osteoarthritis,OA)比较,OR=11.29,95%CI(5.55,22.97), P<0.00001, RA与健康对照组(healthy controls, HC)相比,差异统计学意义OR=6.80,95%CI(3.96,11.67), P<0.00001,RA与反应性关节炎(reactive arthritis, ReA)比较无统计学差异OR=1.02,95%CI(0.51,2.06), P=0.95, RA与痛风关节炎(gouty arthritis, GA)比较无统计学差异OR=3.38,95%CI(0.80,14.19),P=0.10。2、临床病例资料分析结果显示结果显示在74例初诊初治RA患者中Uu阳性者41例(55.4%)。Uu感染与RA患者血清抗CCP抗体、RF-IgA、活动指数(DAS28)、ESR、CRP、骨密度降低或骨质疏松、手、腕关节Ⅱ期X线改变阳性率呈高度相关。3、UuLAMPs刺激RASFs增殖在一定浓度和时间范围内呈剂量和时间依赖性,在0.2μg/ml,24h时可刺激RASFs增殖最显著,与其他浓度和时间点相比,有统计学意义。UuLAMPs刺激正常人SFs也可引起增殖,但是无浓度和时间依赖趋势。PMA刺激THP-1细胞获得THP-1源巨噬细胞的细胞形态。UuLAMPs刺激THP-1源巨噬细胞分泌TNF-a和IL-1βpmRNA和蛋白水平在一定范围内升高。以UuLAMPs为抗原检测Uu阳性不孕症、ReA、Uu阴性RA、Uu阳性RA和Uu阴性健康志愿者血清中抗UuLAMPs的抗体,western blot法检测出具有强免疫原性的蛋白片段,与考马斯亮蓝R250染色后的凝胶对比,筛选出可能在RA发病中起作用的分子量为25kD的蛋白片段。结论1、①Meta分析显示,RA与支原体感染有关。②支原体在RA患者中的感染率高于OA组和健康对照组,不高于ReA组和GA组。③支原体在RA中的地位是否等同于在ReA中的地位,需要大样本的临床研究及基础研究。④RA与GA组支原体感染率的比较由于GA组病例数少,尚需要大样本的科学研究进一步证实。2、临床病例分析显示Uu感染与RA存在相关性,并且与部分抗体学指标(包括抗CCP抗体)、炎症指标、活动指标、影像学指标有相关性,提示Uu可能参与RA早期发病。3、UuLAMPs干预RASFs和THP-1源巨噬细胞,在一定范围内可以促进细胞增殖和细胞因子紊乱,是UuLAMPs参与RA发病的机制之一。UuLAMPs中存在具有强免疫原性的蛋白片段,其中的25kD片段可能在RA患者发病中起作用。

全文目录

中文摘要  8-13
ABSTRACT  13-18
主要符号说明  18-20
第一部分支原体感染与类风湿关节炎相关性研究的Meta分析  20-39
  前言  20-22
  研究对象和方法  22-24
  结果  24-33
  讨论  33-36
  小结  36-37
  参考文献  37-39
第二部分解脲脲原体感染类风湿关节炎患者的临床特征分析  39-51
  前言  39-40
  研究对象和方法  40-43
  结果  43-45
  讨论  45-48
  小结  48-49
  参考文献  49-51
第三部分解脲脲原体脂质相关膜蛋白在类风湿关节炎发病机制中的研究  51-90
  前言  51-52
  研究对象和方法  52-76
  结果  76-83
  讨论  83-86
  小结  86-87
  参考文献  87-90
附录  90-95
附图与附表  95-101
致谢  101-102
攻读学位期间发表或已录用的论文  102-103
学位论文评阅及答辩情况表  103-104
英文论文1  104-123
英文论文2  123-133

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