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水稻中天冬氨酸转氨酶的分子生物学研究和转基因应用

作　者: 周莹
导　师: 张启发；练兴明
学　校: 华中农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 水稻天冬氨酸转氨酶蛋白质含量氨基酸含量遗传转化大肠杆菌氮代谢
分类号: S511
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

水稻不仅是我国主要的粮食作物,还养活着世界一半的人口。在水稻氮代谢途径中,有一些重要的酶(例如GS、GOGAT、GDH、AAT和AS),调控着水稻氮素的代谢。有研究发现,尤其是编码天冬氨酸转氨酶的AAT基因,与控制蛋白质和氨基酸含量的QTL有对应的关系。本研究在水稻品种中花11(来自与中国农业科学院作物科学研究所的商业品种)中超量表达了AAT基因(包括来源于水稻的3个AAT基因:OsAAT1、OsAAT2和OsAAT3;来源于大肠杆菌的1个AAT基因:EcAAT),同时抑制表达AAT这个基因。得到转基因植株后,分析了转基因植株的生长和代谢水平与对照植株的差异,研究了这两个基因的表达情况和作用机理。综合分析2004年和2007年数据,得出以下几个主要结果:1、得到了超量表达AAT的转基因植株(如上所述,共试图超量表达4个片段)。2、t测验(t-test)表明,超量表达AAT基因的转基因植株,不管在正常生长条件下,还是各种胁迫生长条件下(包括低氮胁迫,NaCl胁迫,ABA胁迫),其生长(包括株高和干重)都与对照没有显著差异。3、t测验(t-test)表明,超量表达AAT基因(包括OsAAT1,OsAAT2和EcAAT基因)的转基因植株的米粉中,氨基酸含量和蛋白质含量明显高于野生型对照。4、超量表达OsAAT1基因的阳性植株的种子中的氨基酸总含量比其对应的阴性植株的含量提高了16.1%,蛋白质含量提高了22.2%;超量表达OsAAT2基因的阳性植株的种子中的氨基酸总含量比其对应的阴性植株的含量提高了12.0%,蛋白质含量提高了21.1%;超量表达EcAAT基因的阳性植株的种子中的氨基酸总含量比其对应的阴性植株的含量提高了5.4%,蛋白质含量提高了11.1%。t测验(t-test)表明,超量表达AAT基因的转基因阳性植株和其对应的阴性植株的米粉中,氨基酸含量和蛋白质含量在阳性植株中显著(P≤0.05)高于其对应的阴性植株。说明氨基酸含量和蛋白质含量的升高是由转基因作用引起的。5、验证AAT基因家族的表达情况,发现AAT基因家族的3个成员的表达受各种胁迫的影响。同时这3个成员在植株的不同部位和不同的生长时期,表达也存在着差异。6、超量表达EcAAT基因,能使植株体内OsAAT1和OsAAT2基因的表达上升。但是水稻体内的3个OsAAT基因的表达并不能相互调控,即超量表达任何一个OsAAT基因,并不能引起其它两个OsAAT基因表达的改变。

全文目录

缩略词表  8-9
摘要  9-11
ABSTRACT  11-13
1 文献综述  13-26
  1.1 遗传育种改良品种  13-14
  1.2 天冬氨酸转氨酶的研究进展  14-17
    1.2.1 天冬氨酸和天冬酰胺的生物合成  14-15
      1.2.1.1 天冬氨酸的生物合成  14
      1.2.1.2 天冬酰胺的生物合成  14-15
    1.2.2 天冬氨酸转氨酶的进展分析  15
    1.2.3 天冬氨酸转氨酶的克隆  15-16
    1.2.4 天冬氨酸转氨酶的调控  16
    1.2.5 天冬氨酸转氨酶在水稻中的情况  16-17
  1.3 稻米蛋白质和氨基酸的研究进展  17-19
    1.3.1 稻米蛋白质的种类  17
    1.3.2 稻米蛋白质的组成和利用  17-18
    1.3.3 影响稻米蛋白质的非遗传因素  18
    1.3.4 蛋白质和氨基酸含量与氨基酸代谢途径基因的关系  18-19
  1.4 研究植物基因功能的策略和方法  19-25
    1.4.1 基因功能增加或获得  20
      1.4.1.1 超量表达(Over-expression)  20
      1.4.1.2 诱导表达(Inducible expression)  20
    1.4.2 基因功能丧失或减少  20-24
      1.4.2.1 插入突变  20-21
      1.4.2.2 反义抑制和共抑制  21-22
      1.4.2.3 RNA干扰(RNAi)  22-24
    1.4.3 基因的异位表达(Ectopic expression)  24-25
  1.5 本研究的意义、目的和创新之处  25-26
2 材料与方法  26-38
  2.1 水稻材料  26
  2.2 用于遗传转化的水稻基因片段  26-27
  2.3 实验所用到的菌株、质粒、载体和感受态细胞  27
  2.4 遗传转化载体的构建和转化  27-30
    2.4.1 骨架载体构建  27-28
    2.4.2 超量表达载体构建  28
    2.4.3 RNAi抑制表达载体的构建  28-29
    2.4.4 遗传转化  29-30
  2.5 DNA提取、转基因植株PCR阳性检测及转基因拷贝数检测  30-31
    2.5.1 DNA提取  30
    2.5.2 PCR阳性检测  30-31
    2.5.3 转基因Southern检测  31
  2.6 RNA的抽提、反转录及杂交  31
    2.6.1 RNA的抽提,反转录  31
    2.6.2 基因表达NORTHERN检测  31
    2.6.3 转基因植株超量表达检测  31
  2.7 PCR、RT-PCR和REAL-TIME PCR的检测  31-32
  2.8 水培试验及性状考察  32-35
    2.8.1 转基因植株的形态表型观察初筛和复筛  32-33
    2.8.2 性状考察  33-35
      2.8.2.1 天冬氨酸转氨酶酶活的测定方法  33-35
      2.8.2.2 游离NO_3~-的测定方法  35
      2.8.2.3 游离NH_4~+的测定方法  35
  2.9 各种胁迫条件下,培养基种植和性状考察  35-36
  2.10 田间种植和性状考察  36-38
    2.10.1 田间实验  36
    2.10.2 性状考察  36-37
      2.10.2.1 蛋白质含量的测定方法  36-37
      2.10.2.2 氨基酸含量的测定方法  37
    2.10.3 转基因植株的性状考察初筛  37
    2.10.4 转基因植株的性状考察复筛  37-38
  2.11 数据收集、整理与统计分析  38
3 结果与分析  38-61
  3.1 骨架载体构建  38-39
  3.2 对天冬氨酸转氨酶基因的获得及序列分析  39-40
  3.3 转化载体的构建及遗传转化  40
  3.4 T_0代转基因植株PCR阳性分析  40-42
  3.5 T_0代转基因植株SOUTHERN拷贝数分析  42-43
  3.6 水稻内源基因的表达模式分析  43-47
    3.6.1 基因芯片分析基因家族OsAAT的表达模式  43-44
    3.6.2 RT-PCR分析基因家族OsAAT的表达模式  44-46
    3.6.3 利用RT-PCR,分析基因家族OsAAT在各种胁迫条件下的表达模  46-47
  3.7 转基因植株超量表达和抑制表达检测  47-49
  3.8 转基因植株中各基因表达量变化的检测  49-52
  3.9 转基因植株水培生理生化鉴定  52-61
    3.9.1 T_1代转基因家系在全营养水培条件下,酶活的测定  52-53
    3.9.2 T_1代转基因家系在全营养水培条件下,游离硝酸盐、铵盐和可溶性蛋白的测定  53-55
    3.9.3 T_1代转基因家系对氮胁迫放应的水培实验  55-56
    3.9.4 T_1代转基因家系在培养基上的胁迫实验  56-57
    3.9.5 T_1代转基因植株,米粉中氨基酸的测定  57
    3.9.6 T_2代转基因植株,米粉中氨基酸含量的复筛和蛋白质测定  57-61
4 讨论  61-72
  4.1 对AAT基因功能的探讨  61-66
    4.1.1 AAT基因对氮吸收的影响  61-62
    4.1.2 超量表达AAT基因对植株代谢的影响  62-63
    4.1.3 超量表达AAT基因能提高植株种子里氨基酸含量  63-66
    4.1.4 超量表达AAT基因提高植株种子里氨基酸含量的重要意义  66
  4.2 有关基因遗传转化的一些思考  66-72
    4.2.1 关于转化实验一些技术操作问题的思考  66-67
      4.2.1.1 农杆菌介导法转化水稻的注意问题  66-67
      4.2.1.2 转基因植株的阳性检测  67
      4.2.1.3 培养基实验和水培实验  67
    4.2.2 T_0代转基因家系表型不稳定的可能原因  67-68
    4.2.3 筛选标记基因在转基因植物中的应用  68-69
    4.2.4 基因家族中多成员在转基因植物中的表达  69-70
    4.2.5 转基因水稻安全性问题  70-72
参考文献  72-82
个人简历  82-83
致谢  83-84
附录A  84-85
附录B  85-92

水稻中天冬氨酸转氨酶的分子生物学研究和转基因应用

内容摘要

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