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Ⅱ型神经纤维瘤病许旺细胞瘤原代细胞培养及NF2基因突变的个体化研究

作　者: 王维
导　师: 杨学军
学　校: 天津医科大学
专　业: 外科学
关键词: Ⅱ型神经纤维瘤病许旺细胞原代培养 S-100 NF2基因分子遗传检测临床干预
分类号: R739.41
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

Ⅱ型神经纤维瘤病又称中枢神经纤维瘤病,为一常染色体显性遗传性疾病,发病率约为2.50/10万,致病责任基因NF2为抑癌基因，定位于染色体22q12.2,全长约为120kb,编码产物为Merlin蛋白。NF2基因突变造成Merlin蛋白缺失与失活,引起细胞失控性生长导致肿瘤形成。Ⅱ型神经纤维瘤病主要表现为双侧前庭神经许旺细胞瘤及多发脑膜瘤等。双侧前庭神经许旺细胞瘤是其典型临床特征,常表现为耳鸣、听力损害、眩晕及平衡障碍,逐渐导致听力下降乃至丧失,严重影响着患者的生存质量及寿命。为探求Ⅱ型神经纤维瘤病较为有效的治疗方法,从细胞水平对该病进行靶向治疗、药物筛查及NF2基因突变个体化研究显得尤为重要。已有研究表明肿瘤性许旺细胞很可能是许旺细胞瘤的来源细胞。本研究拟通过Ⅱ型神经纤维瘤病组织标本提取并纯化肿瘤性细胞,为进一步研究改善Ⅱ型神经纤维瘤病的医学处理建立体外实验平台。Ⅱ型神经纤维瘤病患者约50%有明确的家族遗传病史,其中50%由新发基因突变引起。NF2基因突变的形式多种,对该病在基因水平上进行个体化研究,可更清楚地了解该病NF2基因突变的个体化差异及与表型的关系,发现该病新的基因突变形式；通过患者及其子女的NF2基因对比,对预测患者子女将来是否发病有重要意义。本研究拟建立临床适用的Ⅱ型神经纤维瘤病的分子遗传分析方法,对Ⅱ型神经纤维瘤病患者及其后代进行分子遗传诊断,以指导Ⅱ型神经纤维瘤病家族的遗传咨询及个体化病情监测、随访及临床干预。本课题研究分以下两个部分：第一部分：建立Ⅱ型神经纤维瘤病肿瘤性许旺细胞体外提取并纯化的方法,以获取足够数量及纯度的细胞,提高原代培养的成功率。利用10例Ⅱ型神经纤维瘤病患者术中收集的的新鲜许旺细胞瘤组织标本为实验材料,Ⅰ型胶原酶消化培养法提取肿瘤性许旺细胞,低浓度胰蛋白酶快速消化法、差数贴壁法和克隆筛选技术纯化细胞。镜下观察细胞形态学,结合免疫细胞化学方法检测S-100蛋白表达,鉴定经体外培养纯化的细胞为肿瘤性许旺细胞。结果显示：10例肿瘤组织标本中成功培养获得肿瘤性许旺细胞者共5例。肿瘤性许旺细胞原代培养至第3天,见大量双极梭形或三角形细胞；利用低浓度胰酶快速消化法和差数贴壁法纯化细胞；培养至第3代,倒置相差显微镜下可见4～5个细胞克隆,免疫细胞化学染色S-100蛋白表达阳性,肿瘤性许旺细胞纯度达>95%,活力良好,可以稳定传代培养。第二部分：建立临床适用的Ⅱ型神经纤维瘤病的分子遗传分析方法,对Ⅱ型神经纤维瘤病病人及其后代进行分子遗传诊断,以指导Ⅱ型神经纤维瘤病家族的遗传咨询及个体化病情监测、随访及临床干预。对上述原代培养的肿瘤性许旺细胞及患者的血液进行基因组DNA抽提；10例Ⅱ型神经纤维瘤病患者中,2例已有后代并知情同意接受基因测序,同时对其后代的血液进行基因组DNA提取；对亲子二代血液及患者的肿瘤性许旺细胞基因组DNA进行NF2基因测序(E1-15及E17外显子及其邻近的内含子)；根据病人的临床表现及病征制定合理的临床干预及随访计划,结合亲子二代分子遗传检测结果,对后代Ⅱ型神经纤维瘤病罹患风险高的人群给予遗传咨询,制定后代的随访计划。本研究启动建立了我科Ⅱ型神经纤维瘤病肿瘤标本库与基因组DNA库；基因测序结果显示肿瘤性许旺细胞与患者血液提取的NF2基因突变位点相同；第一组母女存在完全相同的基因突变位点,第二组母子基因突变位点不完全一致,检测到的突变位点均位于靠近外显子的调控区。结论：1.应用体外原代培养方法结合低浓度酶快速消化法、差数贴壁法及克隆筛选,能够有效剔除许旺细胞瘤组织中的纤维母细胞,获得纯度高、活力好的肿瘤性许旺细胞,可用于Ⅱ型神经纤维瘤病发病及治疗研究。2.建立Ⅱ型神经纤维瘤病许旺细胞瘤组织标本及基因组DNA库为该病分子遗传研究提供组织及基因组DNA资源；分子遗传分析方法可以很好的指导该病的临床工作,提前预计后代罹患风险,对高风险人群制定个体化的随访计划,对该病做到早发现及早治疗；与病人建立长期随访计划,给予其个体化的病情监测及临床干预,可以提高患者的生活质量,延长生存期。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-10
缩略语/符号说明  10-11
前言  11-13
  研究现状、成果  11
  研究目的、方法  11-13
一、Ⅱ型神经纤维瘤病肿瘤性许旺细胞提取与纯化的体外研究  13-30
  1.1 对象和方法  13-24
  1.2 结果  24-26
  1.3 讨论  26-29
  1.4 小结  29-30
二、Ⅱ型神经纤维瘤病分子遗传分析指导临床个体化诊疗的研究  30-48
  2.1 对象和方法  30-36
  2.2 结果  36-44
  2.3 讨论  44-47
  2.4 小结  47-48
结论  48-49
参考文献  49-53
发表论文和参加科研情况说明  53-54
综述 Ⅱ型神经纤维瘤病的研究进展  54-68
  综述参考文献  63-68
致谢  68

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