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色素上皮衍生因子基因修饰的间充质干细胞靶向治疗肝癌的实验研究

作　者: 高云
导　师: 王学浩
学　校: 南京医科大学
专　业: 普外科
关键词: 间充质干细胞色素上皮衍生因子慢病毒载体肝癌血管形成
分类号: R735.7
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的构建人色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor, PEDF)重组慢病毒并体外感染骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BM-MSCs),研究PEDF的体外表达情况和生物学活性。方法将人全长PEDF cDNA亚克隆至慢病毒表达质粒pLV-GFP,并通过酶切和测序鉴定。磷酸钙共沉淀法将慢病毒表达质粒和两个包装质粒共转染293T细胞,收集病毒上清。用超滤法纯化病毒,并通过用荧光激活细胞分选术(Fluorescence-activated cell sorter,FACS)进行病毒滴度测定。从人骨髓中分离、培养MSCs并体外感染重组慢病毒。荧光显微镜下观察感染细胞的GFP表达情况,并通过流式细胞仪检测人间充质干细胞(human mesenchymal stem cells, hMSCs)的感染效率。分别通过RT-PCR、Western blot、酶联免疫吸附测定法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测感染细胞PEDF的表达水平,并通过人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)小管形成实验检测重组PEDF的生物学活性。结果慢病毒表达质粒pLV-PEDF-GFP经限制性内切酶酶切电泳后显示1.3kb的PEDF目的基因片段,测序结果表明目的片段与Gene bank中PEDF cDNA序列完全一致,且插入方向正确;经293T包装后产生LV-PEDF-GFP重组慢病毒,其滴度为5×107-1×108 TU/mL,纯化后滴度可达2×1010 TU/mL。病毒感染hMSCs后,荧光显微镜下观察,几乎所有细胞都表GFP,流式细胞仪检测hMSCs的感染效率可达96.38%。RT-PCR结果显示,hMSCs-PEDF在mRNA水平上有PEDF高表达。Western blot和ELISA结果表明,hMSCs-PEDF能够高效表达PEDF蛋白,且重组PEDF可抑制HUVECs的小管形成。结论本实验成功构建PEDF重组慢病毒载体,重组慢病毒感染hMSCs后,能够高效表达具有生物学活性的PEDF。骨髓间充质的分离、培养及基因修饰的成功,为其进一步的体内、外研究奠定了物质基础。目的研究肿瘤细胞条件培养基能否刺激hMSCs的迁移;建立肝癌裸鼠原位模型,观察hMSCs经尾静脉注射后能否向肿瘤组织趋向转移。方法(1)收集肿瘤细胞条件培养基,利用Transwell小室进行hMSCs的体外迁移实验。(2)利用转LV-GFP的MHCC-97H细胞建立转移性肝癌裸鼠原位模型,hMSCs经CM-DiI标记后通过尾静脉输入荷瘤裸鼠体内,分别在hMSCs注射后7天和14天,处死裸鼠,取肝脏、肺、脾、心、脑、胰、肾组织,冰冻切片于荧光显微镜下观察hMSCs在体内的分布。结果与对照组相比,hMSCs、hMSCs-PEDF向肝癌细胞条件培养基迁移的细胞数明显增加(*p < 0.001),说明肝癌细胞分泌的某些因子能够刺激hMSCs的趋向性转移,且慢病毒的转染不影响hMSCs的迁移能力。尾静脉注射后7天,hMSCs主要分布于肿瘤与正常肝组织的交界处,但仍有少数hMSCs滞留于肺组织;注射后14天,hMSCs广泛分布于肿瘤组织,此时,在肺部已检测不到hMSCs;而hMSCs注射后7天及14天,均未在其它组织(脾、心、脑、胰、肾)观察到其存在。结论本研究证实了BM-MSCs具有向肝癌迁移的能力,为下一步利用hMSCs作为载体进行肝癌治疗的研究提供了有力的依据。目的观察hMSCs-PEDF经尾静脉注射后对肝癌生长和肺转移的影响。方法在肝脏原位接种肿瘤10天后,将裸鼠随机分为4组(每组22只),通过尾静脉分别注射PBS、hMSCs-GFP、hMSCs-PEDF和重组慢病毒LV-PEDF。治疗后35天,处死裸鼠(每组12只);取肝脏组织,测量肿瘤体积;观察不同治疗方法对肝癌生长和肺转移的影响。余下每组10只用于生存期观察。抗CD34抗体免疫组化染色分析肝脏肿瘤中的血管密度,并通过ELISA检测血清中的PEDF浓度。结果hMSCs-PEDF治疗能够显著抑制肝癌的生长和自发性肺转移,并明显延长荷瘤裸鼠的生存期,且hMSCs-PEDF治疗组血清中PEDF水平明显低于LV-PEDF治疗组。免疫组化结果显示,hMSCs-PEDF治疗能够显著降低肝脏肿瘤中的血管密度。结论本研究首次报道了利用hMSCs作为载体进行肝癌治疗的实验研究,并取得了显著的治疗效果,为肝癌的治疗提供了一条新的思路。

全文目录

缩略词  5-7
中文摘要  7-11
Abstract  11-17
第一部分色素上皮衍生因子慢病毒载体的构建及体外感染骨髓间充质干细胞  17-44
  引言  17-18
  材料和方法  18-31
  结果  31-42
  讨论  42-43
  小结  43-44
第二部分骨髓间充质干细胞靶向肝癌迁移的研究  44-53
  引言  44-45
  材料和方法  45-47
  结果  47-52
  讨论  52
  小结  52-53
第三部分 hMSCs-PEDF 靶向治疗肝癌的实验研究  53-61
  引言  53-54
  材料和方法  54-55
  结果  55-59
  讨论  59-60
  小结  60-61
参考文献  61-68
综述  68-82
  参考文献  75-82
发表论文  82-83
致谢  83

色素上皮衍生因子基因修饰的间充质干细胞靶向治疗肝癌的实验研究

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