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采用同源重组技术构建PrA低表达且能分泌LTP1的酿酒酵母菌株及其性能研究

作　者: 张洪波
导　师: 何国庆
学　校: 浙江大学
专　业: 食品科学
关键词: 工业酿酒酵母菌株 同源重组 大麦脂转移蛋白1 蛋白酶A 啤酒泡沫稳定性
分类号: TS201.3
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


酿酒酵母蛋白酶A(PrA)〔EC3.4.23.25〕为酿酒酵母产生的一种酸性蛋白水解酶。纯生啤酒采用低温膜过滤除菌达到生物稳定性,因而蛋白酶A的活性不被破坏。由于啤酒的pH值在4.3-4.4的酸性范围内,因此啤酒被消费者消费之前,蛋白酶A都会降解啤酒中的蛋白和多肽,尤其是当啤酒中的泡沫阳性蛋白被蛋白酶A降解后会导致啤酒的泡沫衰减、泡持性降低。啤酒的泡沫性能是用来衡量啤酒质量的一个重要指标。前人的研究结果证实啤酒中的大麦脂转移蛋白1(LTP1)是对啤酒泡沫稳定性最为关键的蛋白,这种蛋白是底物特异性较小的酵母蛋白酶A的作用底物,这使得纯生啤酒的泡沫衰减问题更加突出。为从根本上解决纯生啤酒的泡沫衰减问题,本研究论文中从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因组中通过PCR分别扩增得到了酿酒酵母乙醇脱氢酶启动子(ADH1 promoter), MFal信号肽序列(MFals)、细胞色素C终止子序列(CYC1 terminator)等表达调控DNA序列；从二棱大麦(Hordeum vulgare)基因组中扩增得到了大麦脂转移蛋白1(LTP1)的编码序列,并构建了酿酒酵母的大麦脂转移蛋白1的表达盒。将遗传霉素G418的抗性序列KanMX作为筛选标记与大麦Ltp1表达盒共同克隆到质粒YEplacl81的多克隆位点中,得到酿酒酵母大麦LTP1分泌表达型质粒YEp181-KAMLC。使用质粒YEpl81-KAMLC对酿酒酵母WZ65进行转化并使用酿酒酵母转化子菌株进行发酵实验,采用HPLC对大麦Ltp1表达盒的下游产物进行检测。检测结果表明,大麦脂转移蛋白1在酿酒酵母菌株WZ65中得到了分泌表达,在发酵开始的24小时内大麦脂转移蛋白1的产量增加较为缓慢,之后有较大的提高,72小时后大麦脂转移蛋白1分泌量的增加速度变慢。随着发酵时间的延长,大麦LTP1的产量-直呈现上升趋势。到发酵的132小时,发酵液中大麦脂转移蛋白1的分泌量达到29.45mg／L。使用含有大麦Ltp1表达盒和KanMX标记序列的转化DNA片段同源重组到酿酒酵母基因组上PEP4基因位点,使一个PEP4等位基因的编码序列被外源基因序列所替换。这样将会使酿酒酵母在表达啤酒泡沫阳性蛋白-大麦LTP1的同时,由于PEP4一个等位基因的缺失而造成其编码产物-蛋白酶A表达的降低,从而达到既增加泡沫阳性蛋白LTP1的含量,又有效降低其被蛋白酶A的降解作用。通过对转化子的筛选和鉴定,得到了基因型为PEP4/pep4::KanMX-Ltpl的酿酒酵母重组子菌株。对得到的重组菌株进行发酵培养,通过采用变性不连续SDS-PAGE釉Tricine-SDS-PAGE方法对经过处理的发酵液进行分析发现,本实验中所用到的对酿酒酵母重组菌分泌到培养液的大麦LTP1两种电泳分析方法中,Tricine-SDS-PAGE方法要比普通的SDS-PAGE方法优越。酵母表达的分子量大小约10KDa的蛋白条带能够得到很好的分离。进一步免疫印迹实验证实,重组菌株分泌的分子量对应于10KDa左右的表达产物为大麦LTP1。为了确保重组菌株在工业生产中的安全性,需要对抗性选择标记KanMX进行删除。TEF1启动子不能被本实验中所用的酿酒酵母表达系统所识别,因此使用TEF promoter更换了Sh ble表达盒中的TEF1 promoter,并构建了质粒pSH47/ZEO,利用Cre/loxP系统对重组子染色体上的KanMX进行了删除,并成功的使酵母细胞丢掉了质粒pSH47/ZEO.最终获得了大麦Ltp1表达盒结构完整、整合位点精确的酿酒酵母重组菌株。对不同发酵时期LTP1的浓度检测结果表明,在12°P未加酒花的麦汁中重组菌株S.c-Ltplα和S.c-Ltplβ在发酵第108小时分泌大麦LTP1的浓度分别达到18.76和18.28mg/L；在8°P添加酒花的麦汁中重组菌株S.c-Ltplα釉S.c-Ltplβ在发酵第108小时分泌大麦LTP1的浓度分别达到12.07和12.13mg/L。对获得的重组菌株S.c-Ltplα釉S.c-Ltplβ进行继代培养并对其遗传稳定性、生长性能、发酵力、絮凝性和蛋白酶A活性等生理生化指标进行了测试。重组菌株经过继代培养30代后遗传性能稳定。重组菌株与出发菌株相比,蛋白酶A活性降低了30%左右,对数生长期变慢,但稳定期的细胞浓度与对照菌基本相当,其他生理指标与对照菌株无明显差异。通过酿酒试验对多项指标的测试结果表明,重组菌株酿造的啤酒口味与现行其他干啤相近,各项理化指标均达到国家标准优级,泡持时间从原来的202s提高到326s。

全文目录


摘要  12-14
Abstract  14-17
第一章 绪论  17-50
  1 前言  17-18
  2 影响纯生啤酒泡沫稳定性的因素  18-25
    2.1 啤酒的泡沫性质  18
    2.2 啤酒泡沫的物理特性  18-21
    2.3 啤酒泡沫的化学分子特性  21-22
    2.4 啤酒的化学成分及其对泡沫的影响  22-23
    2.5 发酵菌种和生产原料对啤酒泡沫的影响  23-24
    2.6 生产工艺对啤酒泡沫的影响  24-25
  3 与啤酒泡沫相关的主要的蛋白和蛋白酶  25-44
    3.1 Z-蛋白  25-27
    3.2 脂转移蛋白1(LTP1)  27-35
      3.2.1 脂转移蛋白1(LTP1)的构成  27-29
      3.2.2 脂转移蛋白1(LTP1)的生物学功能  29-31
      3.2.3 脂转移蛋白1(LTP1)对啤酒泡沫的影响  31-34
      3.2.4 脂转移蛋白1(LTP1)在植物中的表达  34-35
    3.3 酿酒酵母蛋白酶A  35-42
      3.3.1 蛋白酶A的编码  35-36
      3.3.2 酵母蛋白酶A的结构  36
      3.3.3 蛋白酶A的生化特性  36-38
      3.3.4 蛋白酶A的分泌途径  38-39
      3.3.5 酵母蛋白酶A对啤酒泡沫稳定性的影响  39-40
      3.3.6 蛋白酶A的测定  40-42
    3.4 液泡内的其它蛋白酶  42-44
  4 改善纯生啤酒泡沫的主要策略  44-45
    4.1 选用优质的生产菌株和原辅料  44
    4.2 优化生产工艺  44
    4.3 使用泡沫添加剂  44-45
  5 利用同源重组技术在酿酒酵母中表达外源基因  45-48
    5.1 同源重组  45-46
    5.2 外源基因在酿酒酵母细胞中的表达  46-47
    5.3 基因工程技术对啤酒质量的改善  47-48
      5.3.1 提高啤酒的胶体稳定性  47
      5.3.2 提高生香物质含量  47
      5.3.3 选育嗜杀啤酒酵母  47-48
      5.3.4 分解葡聚糖  48
  6 前景与展望  48-49
  7 选题背景与研究思路  49-50
第二章 大麦Ltp1酿酒酵母表达盒的构建  50-81
  1 前言  50-51
  2 材料和方法  51-60
    2.1 材料、主要试剂和仪器设备  51-53
      2.1.1 种子、菌株、质粒  51
      2.1.2 主要试剂及配制  51-52
      2.1.3 培养基  52
      2.1.4 主要实验仪器和设备  52-53
    2.2 实验方法  53-60
      2.2.1 二棱大麦(Hordeum vulgare)基因组提取  53-54
      2.2.2 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因组提取  54-55
      2.2.3 大麦Ltp1酿酒酵母表达盒的构建  55-60
  3 结果与讨论  60-80
    3.1 基因片段的扩增  60-65
      3.1.1 大麦脂转移蛋白1编码基因(Ltp1)的扩增  60-61
      3.1.2 乙醇脱氢酶启动子(ADH1 promoter,ADH1_p)序列的扩增  61-62
      3.1.3 分泌信号MFα1_s的扩增  62-63
      3.1.4 酿酒酵母细胞色素C终止子(CYC1 terminator,CYC1_T)序列的扩增  63-64
      3.1.5 KanMX的扩增  64-65
    3.2 大麦Ltp1表达盒的构建  65-80
      3.2.1 MFα1_s与Ltp1基因片段的三引物连接  65-67
      3.2.2 ML片段与CYC1终止子DNA片段的连接  67-68
      3.2.3 复合DNA片段MLC的PCR鉴定  68-69
      3.2.4 ADH1启动子克隆到载体pUC18  69-72
      3.2.5 复合DNA片段MLC克隆到质粒pUC-ADH1p  72-80
  4 小结  80-81
第三章 大麦Ltp1酿酒酵母表达盒的测试  81-96
  1 前言  81-82
  2 材料与方法  82-88
    2.1 材料、主要试剂和仪器  82-84
      2.1.1 菌株、质粒  82
      2.1.2 主要试剂及配制  82-83
      2.1.3 培养基  83
      2.1.4 主要实验仪器和设备  83-84
    2.2 实验方法  84-88
      2.2.1 PCR 引物的合成  84
      2.2.2 基因片段的PCR扩增  84
      2.2.3 酶切与连接  84-85
      2.2.4 琼脂糖凝胶电泳  85
      2.2.5 酿酒酵母的电击转化  85-87
      2.2.6 酿酒酵母转化子的筛选  87
      2.2.7 表达产物的检测  87-88
  3 结果与分析  88-94
    3.1 DNA片段KAMLC的PCR扩增  88-90
    3.2 DNA片段KAMLC的鉴定  90
    3.3 质粒YEp181-KAMLC的构建  90
    3.4 质粒YEp181-KAMLC的鉴定  90-92
    3.5 酿酒酵母转化子的鉴定  92-93
    3.6 大麦LTP1的HPLC标准曲线  93-94
    3.7 YEp181-KAMLC酿酒酵母转化子LTP1的分泌表达  94
  4 讨论  94-95
  5 小结  95-96
第四章 大麦Ltp1表达盒在酿酒酵母PEP4位点的重组  96-113
  1 前言  96-97
  2 材料与方法  97-105
    2.1 材料、主要试剂和仪器  97-100
      2.1.1 菌株、质粒  97
      2.1.2 主要试剂及配制  97-99
      2.1.3 酿酒酵母培养基  99-100
      2.1.4 主要实验仪器和设备  100
    2.2 实验方法  100-105
      2.2.1 PCR引物的合成  100-101
      2.2.2 酿酒酵母同源重组转化DNA片段的PCR扩增  101
      2.2.3 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳  101-102
      2.2.4 酿酒酵母的电击转化  102
      2.2.5 酿酒酵母转化子的筛选  102
      2.2.6 表达产物的免疫印迹检测  102-105
  3 结果和分析  105-111
    3.1 重组转化DNA片段的PCR扩增  105-106
    3.2 酿酒酵母转化子的筛选与鉴定  106-108
      3.2.1 重组位点鉴定  106-107
      3.2.2 重组位点的等位基因  107-108
      3.2.3 重组子基因型的确定  108
    3.3 表达产物的变性电泳  108-110
    3.4 表达产物的免疫学检测  110-111
  4 讨论  111-112
    4.1 基因重组的位点  111-112
    4.2 酿酒酵母重组子发酵产物的蛋白电泳  112
  5 小结  112-113
第五章 酿酒酵母重组子抗性标记基因的删除  113-130
  1 前言  113-114
  2 材料与方法  114-121
    2.1 材料、主要试剂和仪器  114-116
      2.1.1 菌株和质粒  114
      2.1.2 主要试剂及配制  114
      2.1.3 培养基  114-115
      2.1.4 主要实验仪器和设备  115-116
    2.2 实验方法  116-121
      2.2.1 ZeoCassette的PCR扩增  116
      2.2.2 Gall Promoter的PCR扩增  116-117
      2.2.3 TEF promoter的PCR扩增  117-118
      2.2.4 Gall promoter与ZeoCassette的连接  118
      2.2.5 TEF promoter与DNA片段EM7_p-Sh ble-CYCl_T-Gall_p的连接  118
      2.2.6 质粒pSH47/ZEO的构建  118
      2.2.7 质粒pSH47/ZEO对酿酒酵母重组子S.c-ltp1的转化  118
      2.2.8 质粒pSH47/ZEO的酿酒酵母转化子的筛选及鉴定  118-119
      2.2.9 Cre重组酶的诱导表达  119
      2.2.10 KanMX~-菌株的筛选  119
      2.2.11 KanMX~-菌株的PCR鉴定  119-120
      2.2.12 KanMX~-菌株的G418抗性实验  120
      2.2.13 质粒pSH47/ZEO的去除  120
      2.2.14 丢失质粒pSH47/ZEO的酵母菌株的PCR鉴定  120
      2.2.15 重组菌株S.c-ltp1中Ltp1表达盒完整性的PCR验证  120-121
  3 结果和分析  121-128
    3.1 ZeoCassette、Gall Promoter和TEF Promoter的PCR扩增  121-123
    3.2 ZeoCassette与Gall Promoter的连接  123
    3.3 TEF promoter与DNA片段EM7p-Sh ble-CYC1_T-Gall_P的连接  123-124
    3.4 质粒pSH47/ZEO的构建  124
    3.5 质粒pSH47/ZEO的酿酒酵母转化子的PCR鉴定  124-125
    3.6 KanMX~-菌株的鉴定  125-126
    3.7 质粒pSH47/ZEO的丢失  126-127
    3.8 重组菌株S.c-Ltp1中Ltp1表达盒的完整性  127-128
  4 讨论  128-129
    4.1 质粒pSH47的改造  128-129
    4.2 KanMX标记基因的删除  129
  5 小结  129-130
第六章 重组酵母菌株的遗传稳定性及其发酵性能  130-141
  1 前言  130
  2 材料与方法  130-134
    2.1 材料和主要试剂  130-131
      2.1.1 酵母菌株  130
      2.1.2 培养基  130-131
      2.1.3 工具酶和主要试剂  131
    2.2 主要仪器和设备  131
    2.3 实验方法  131-134
      2.3.1 重组菌与对照菌的继代培养  131-132
      2.3.2 重组菌株抗性丢失的遗传稳定性  132
      2.3.3 重组菌株Ltp1表达盒的遗传稳定性  132
      2.3.4 蛋白酶A的活性  132-133
      2.3.5 大麦LTP1的表达  133
      2.3.6 生长性能试验  133
      2.3.7 发酵力试验  133-134
      2.3.8 凝聚性试验  134
  3 结果和分析  134-140
    3.1 重组子抗性丢失的遗传稳定性  134-135
    3.2 重组子Ltpl表达盒的遗传稳定性  135-136
    3.4 脂转移蛋白1的分泌性能及传代稳定性  136-138
    3.5 生长性能  138-139
    3.6 发酵性能  139
    3.7 凝聚性  139-140
  4 讨论  140
  5 小结  140-141
第七章 重组菌株的酿酒试验  141-146
  1 前言  141
  2 材料与方法  141-143
    2.1 酵母菌种及原料  141
    2.2 主要仪器  141-142
    2.3 实验方法  142-143
      2.3.1 麦汁培养基的制备  142
      2.3.2 啤酒酿造试验方法  142-143
      2.3.3 理化指标及性能分析  143
  3 结果与讨论  143-144
    3.1 各种理化指标的测定结果  143
    3.2 酵母菌性能测试  143-144
  4 小结  144-146
第八章 主要结论  146-150
  8.1 结论  146-148
  8.2 主要创新成果  148
  8.3 展望  148-150
参考文献  150-169
致谢  169-170
攻读博士期间发表学术论文  170

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中图分类: > 工业技术 > 轻工业、手工业 > 食品工业 > 一般性问题 > 基础科学 > 食品微生物学
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