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hS100A6对人骨肉瘤细胞株143B的作用及机制探讨

作　者: 李星星
导　师: 周兰
学　校: 重庆医科大学
专　业: 生物医学工程
关键词: S100A6 骨肉瘤 Wnt/β-catenin信号途径 Co-IP 酵母双杂交
分类号: R738.1
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

研究背景和目的肿瘤的发生发展是一个多因素作用、多基因参与、经历多个阶段的复杂生物学过程,有许多信号分子参与其中。这些信号分子对肿瘤的作用、作用机制以及信号分子之间的相互关系均较复杂,尚待阐明。S100蛋白家族是一类具有EF-手形结构的钙结合蛋白信号分子,至少有25个成员。与钙离子及其靶蛋白结合后发挥多种生理功能:参与细胞增殖和分化、调节钙稳态、蛋白质磷酸化、酶活性及转录因子的调节。现已发现其中多个成员在肿瘤中表达异常,并参与肿瘤发生发展。S100A6就是其中的一员,在多数上皮肿瘤、多数骨肉瘤、卵巢癌等多种肿瘤细胞中高表达,但是其对肿瘤的作用尚无定论。基于此,本课题拟进一步研究S100A6对人骨肉瘤的体内和体外作用。Wnt/β-catenin信号途径是公认的与肿瘤发生发展密切相关的信号途径,β-catenin是其关键的信号分子。胞浆中β-catenin增多后,可转移到胞核,进而与其相应的转录因子结合,导致该信号途径下游靶基因的转录激活;这些靶基因(如c-myc、细胞周期素D1等)具有促进细胞增殖和迁移等作用。β-catenin的高表达和该信号途径的失调常见于大多数肿瘤,包括骨肉瘤。我们前期的研究发现:1)S100A6可以抑制人骨肉瘤细胞MG63和U2OS的增殖和迁移;2)S100A6可以增加骨肉瘤细胞MG63和U2OS中Wnt信号活性;3)Pull-down分析发现S100A6与Wnt信号途径的多个成员,β-catenin、糖原合成酶激-3β(glycogen synthase kinase,GSK-3β)和散乱蛋白DVL(dishevelled,DVL)之间有体外相互作用;同时,S100A6的高表达与β-catenin的增多和Wnt/β-catenin信号途径的失调常常同时存在于骨肉瘤。基于上述,我们推测:S100A6可能参与调节Wnt/β-catenin信号途径的活性,并因此实现对骨肉瘤细胞的生物学作用。为验证此假设,本课题拟通过蛋白质印迹法进一步探讨S100A6对另一株人骨肉瘤细胞143B中β-catenin水平的影响和通过免疫共沉淀的方法进一步确认S100A6与Wnt/β-catenin信号途径中主要成员之间直接相互作用的存在。同时,我们也拟通过酵母双杂交技术探寻与S100A6存在相互作用的分子,为全面地了解S100A6对骨肉瘤的作用及机制提供新的线索。综上,本课题拟通过重组腺病毒感染的方式分别转入hS100A6基因及其siRNA基因,探讨hS100A6对人骨肉瘤细胞株143B细胞的体外作用(增殖、迁移和凋亡)和体外作用以及对该细胞中β-catenin的影响;通过免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)方法,探讨hS100A6与Wnt信号途径的主要成员(β-catenin、GSK-3β、DVL和Axin)之间是否存在直接相互作用;同时,通过酵母双杂交方法寻找人骨肉瘤细胞株143B细胞中与S100A6相互作用的分子,为阐明S100A6对骨肉瘤细胞的作用及可能机制积累更翔实的实验依据,为发现骨肉瘤诊断和预后判断的分子标志物以及治疗的新靶点奠定基础。方法1.利用HEK293细胞扩增分别携带hS100A6基因、hS100A6的siRNA基因和β-catenin基因的重组腺病毒AdS100A6、AdsiS100A6和Adβ-catenin;也同样方法扩增它们的对照腺病毒(AdGFP和AdRFP)。2.通过重组腺病毒AdS100A6和AdsiS100A6分别上调和下调人骨肉瘤细胞143B中S100A6的表达后,用MTT法和台盼兰染色活细胞计数法检测细胞的增殖活性,Hoechst染色检测细胞凋亡, Transwell小室检测细胞的迁移能力。同时,在动物荷瘤模型上观察hS100A6对骨肉瘤的体内作用。3.通过重组腺病毒AdS100A6和AdsiS100A6分别上调和下调人骨肉瘤细胞S100A6的表达后, Western Blot检测β-catenin蛋白的表达。4.用Co-IP方法检测S100A6与Wnt/β-catenin信号途径的主要成员β-catenin、GSK-3β、DVL和Axin之间的直接相互作用。5.利用Clontech试剂盒构建用于酵母双杂交的143B细胞的cDNA文库后,用酵母双杂交方法寻找143B细胞中与S100A6相互作用的分子。结果1.重组腺病毒感染的HEK293细胞中有相应的绿色或红色荧光蛋白表达,在72 h时感染率约为90%;扩增所获病毒液的滴度为108-109 pfu/ml。2.免疫细胞化学法证实:感染AdS100A6后的143B细胞中,S100A6的表达是实验对照组(AdGFP组)的1.19倍,而感染AdsiS100A6后的143B细胞中S100A6的表达仅为AdGFP组的61.2%,差异具有统计学意义(P<0.01)。提示:重组腺病毒AdS100A6和AdsiS100A6均能将其携带的基因导入目的细胞,并正常表达,即两种重组腺病毒的干预有效。3.外源性hS100A6能抑制人骨肉瘤细胞株143B细胞的增殖和迁移,并促进细胞凋亡,同时能抑制人骨肉瘤细胞株143B的裸鼠皮下移植瘤的生长,甚至转移。(1)MTT结果示:Ad100A6干预72 h后开始出现细胞增殖活性的减弱,并呈时间依赖性,OD值分别为AdGFP组的94.35%,88.66%和86.61%(P<0.05);AdsiS100A6干预48 h后开始出现时间依赖性地细胞增殖活性的增强,OD值分别为AdGFP组的109%,106%,126%和120%(P<0.05);实验对照组AdGFP与空白组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。应用台盼兰染色活细胞计数法所获得的实验结果与MTT法的结果一致。(2)Hoechst法检测结果显示:AdS100A6组的细胞在48和72 h的细胞凋亡率分别较AdGFP组增加25.3%,37.2%和45.8%(P<0.05)96 h时细胞崩解坏死明显;而AdsiS100A6组的细胞凋亡率自48 h起明显降低,分别较AdGFP组降低11.7%,25.9%,36.4%和39.3%(P<0.05)。AdGFP组与空白组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。(3)Transwell分析显示AdS100A6组72 h时穿过膜的细胞数较AdGFP组减少41.2%(P<0.01),AdsiS100A6组则较AdGFP组增加了60.3%(P<0.01),AdGFP组与空白组之间的差异无显著性(P>0.05)。(4)用不同处理因素处理的等量人骨肉瘤细胞143B接种入裸鼠皮下,30天时处死,空白组、AdGFP组、AdS100A6组、AdsiS100A6组的瘤体体积分别为:2796±154 mm~3、2876±263mm~3、1716±120mm~3、4520±400 mm~3,空白组和AdGFP组间差异无显著性(P>0.05),AdS100A6组、AdsiS100A6组与对照组比较差异均具显著性(P<0.01),两实验组组间差异也具有统计学意义(P<0.01)。同时在AdsiS100A6组发现有1只裸鼠肝转移,其它组均未发现。提示:外源性hS100A6能抑制人骨肉瘤细胞株143B细胞的增殖和迁移,并促进细胞凋亡,同时能抑制人骨肉瘤细胞株143B的裸鼠皮下移植瘤的生长,甚至转移。5.外源性hS100A6增加人骨肉瘤细胞143B中β-catenin表达。AdS100A6作用于143B细胞48 h后,能显著增加细胞中β-catenin水平,是AdGFP组的1.64倍(P<0.01);与此同时,AdsiS100A6能降低细胞中β-catenin水平,仅为AdGFP组的79.8%(P<0.05)。AdGFP组与空白组之间的差异无统计学意义。提示:外源性hS100A6可增加人骨肉瘤细胞株143B的β-catenin水平。6. hS100A6与Wnt/β-catenin信号途径主要成员β-catenin、GSK-3β和DVL之间存在直接相互作用;未检测到与Axin之间的直接相互作用。(1)hS100A6与β-catenin之间存在直接相互作用用pHAHA-S100A6转染HEK293细胞,再用Adβ-catenin感染HEK293细胞,48 h后裂解细胞,用抗HA-tag的抗体沉淀含S100A6蛋白的复合物,后者再用抗β-catenin的抗体行Western Blot检测,出现分子量约42 kD的阳性条带,提示β-catenin存在于含S100A6蛋白的复合物中。同样,在用抗β-catenin的抗体沉淀的复合物中,也发现了S100A6的存在。提示:hS100A6与β-catenin之间存在直接相互作用。(2)hS100A6与GSK-3β之间有直接相互作用将pGST-S100A6和pcDNA-GSK-3β-HA共转染HEK293细胞,48 h后裂解细胞,用抗S100A6的抗体沉淀含S100A6蛋白的复合物,用抗HA-tag的抗体进行Western Blot分析,发现GSK-3β的存在。同样,在用抗HA-tag的抗体沉淀的复合物中,也发现了S100A6的存在。提示:hS100A6与GSK-3β之间存在直接相互作用。(3)hS100A6与DVL之间有直接相互作用将pHAHA-S100A6和pCMV-DVL-myc共转染HEK293细胞,48 h后裂解细胞,用抗HA-tag的抗体沉淀S100A6蛋白,用抗-Myc的抗体进行Western Blot,发现DVL蛋白的存在。同样,在用抗-Myc的抗体沉淀的复合物中,也发现了S100A6的存在,提示:hS100A6与DVL之间存在直接相互作用。(4)没有检测到hS100A6与Axin之间的相互作用将pHAHA-S100A6和pCMV-Axin-Myc共转染HEK293细胞,48 h后裂解细胞,用抗HA-tag的抗体沉淀S100A6蛋白,用抗-Myc的抗体进行Western Blot,没有发现阳性条带,提示没有Axin蛋白的存在。同样,在用抗-Myc的抗体沉淀的复合物中,也没有发现S100A6的存在。提示:hS100A6与Axin之间可能没有直接相互作用。7.成功构建人骨肉瘤细胞株143B的酵母双杂交cDNA文库(1)成功提取143B细胞总RNA,分离纯化mRNA结果显示:RNA28S带和18S带清晰,可以用于下一步实验;紫外分光光度计显示:mRNA浓度高,其OD260 /OD280比值在1.8-2.0区间,证明纯度合适,适宜进行下一步实验。(2)文库双链合成电泳图显示cDNA双链呈弥散状,均在200-10000bp之间,且双链稍大于第一链,与预期相符。(3)文库滴度测定及多态性分析计算文库滴度为7.6×10~7 CFU/ml;菌落PCR结果显示,10个菌落有9个扩增出插入片段,即文库重组率为90%;插入片段大小较为集中,均在500-1000 bp之间。8.成功构建酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7-S100A6用设计的引物从pGST-S100A6中扩增出S100A6基因片段,亚克隆至pGBKT7载体,经测序验证pGBKT7- S100A6重组质粒构建成功。经检测:pGBKT7-S100A6质粒的表达产物对AH109酵母细胞的生长没有毒性作用,也无渗漏和自激活。9.运用酵母双杂交方法检测143B细胞中与hS100A6存在相互作用的分子将文库转入Y187酵母细胞,同诱饵质粒共转入酵母AH109细胞,在选择性营养缺陷培养基上划板生长,经过4轮高严谨度筛选后,最终仅获得2个有插入片段的阳性克隆。经测序和经BLAST核苷酸相似性分析,这2个阳性克隆分别与S100A6蛋白编码基因和pGBKCg载体序列同源性高。这2个阳性克隆尚待进一步验证。结论1.外源性hS100A6能抑制人骨肉瘤细胞株143B细胞的增殖和迁移,并促进细胞凋亡,同时能抑制人骨肉瘤细胞株143B的裸鼠皮下移植瘤的生长,甚至转移。2. hS100A6能够增加人骨肉瘤细胞株143B的β-catenin表达;hS100A6可能是导致骨肉瘤中β-catenin增加及Wnt/β-catenin信号途径活性增强的机制之一。3. hS100A6与Wnt/β-catenin信号途径主要成员β-catenin、GSK-3β和DVL之间存在直接相互作用,这可能是上调β-catenin及Wnt/β-catenin信号途径活性的部分机制;未检测到hS100A6与Axin之间的直接相互作用。4.成功构建人骨肉瘤细胞株143B的酵母双杂交cDNA文库。5.成功构建酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7-S100A6。6.运用酵母双杂交方法检测到2个阳性克隆,其编码基因分别与S100A6基因和pGBKCg载体序列的同源性高。尚待进一步验证。7.基于上述,我们推测: hS100A6对骨肉瘤的抑制性作用可能是经由其它信号途径介导的;hS100A6同时激活这些抑制性信号途径以及Wnt/β-catenin信号途径,通过这些途径之间的相互拮抗,实现对骨肉瘤细胞的增殖、迁移和凋亡能力的精细地调控。本研究为阐明hS100A6对骨肉瘤细胞的作用以及hS100A6与Wnt/β-catenin信号途径主要成员之间的相互关系等提供了实验依据。

全文目录

英汉缩略语名词对照  6-8
中文摘要  8-17
英文摘要  17-26
论文正文：hS100A6 对人骨肉瘤细胞株1438 的作用及机制探讨  26-96
  前言  26-31
    参考文献  29-31
  第一部分 hS100A6 对人骨肉瘤细胞株 143B 的体内体外作用  31-55
    第一节人骨肉瘤细胞株 143B 中 S100A6 的内源性表达、 hS100A6 及其 siRNA 的重组腺病毒(AdS100A6 和 AdsiS100A6)的制备及感染有效性的验证  31-40
      1 材料和方法  31-34
      2 实验结果  34-39
      3 讨论  39-40
    第二节 hS100A6 对人骨肉瘤细胞 143B 的增殖、凋亡和迁移能力的影响  40-47
      1 材料与方法  40-42
      2 实验结果  42-46
      3 讨论  46-47
    第三节 hS100A6 对人骨肉瘤细胞 143B 的体内作用  47-53
      1 材料与方法  47-48
      2 实验结果  48-52
      3 讨论  52-53
      4 小结  53
    参考文献  53-55
  第二部分 hS100A6 对人骨肉瘤细胞株 143B 中 β-catenin水平的影响及S100A6与Wnt/β-catenin信号途径中的主要分子之间的直接相互作用  55-70
    1 材料与方法  55-60
    2 实验结果  60-65
    3 讨论  65-68
    4 小结  68
    参考文献  68-70
  第三部分酵母双杂交法筛选人骨肉瘤株 143B 细胞中与 S100A6 相互作用的分子  70-96
    第一节用于酵母双杂交的人骨肉瘤株 143B 细胞的 cDNA 文库的建立  70-78
      1 材料与方法  70-76
      2 实验结果  76-78
    第二节酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-S100A6 的构建、鉴定以及其在酵母中的毒性、渗漏和自激活实验  78-82
      1 材料和方法  78-80
      2 实验结果  80-82
    第三节酵母双杂交筛选 S100A6 相互作用分子  82-94
      1 材料和方法  83-85
      2 实验结果  85-91
      3 讨论  91-94
      4 总结  94
    参考文献  94-96
全文总结  96-97
文献综述  97-105
致谢  105-106
博士期间发表的论文  106-107

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