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顺铂处理后的骨肉瘤细胞中wrap53和p53基因的表达情况研究

作　者: 袁建敏
导　师: 杜世新
学　校: 汕头大学
专　业: 外科学
关键词: p53 wrap53 顺铂 骨肉瘤 siRNAs
分类号: R738.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 27次
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内容摘要


目的:在哺乳动物基因组中反义转录本是一种广泛存在的现象。目前认为这种反义转录本对于基因表达起着调控作用,然而其确切的功能及重要性还远没有被认识。最近发现的p53的自然反义转录本wrap53,调节内源性的p53 mRNA水平进而诱导蛋白的表达,这一生物学作用的机制目前认为是由于wrap53的mRNA与p53 mRNA的5’非翻译区互补结合从而稳定p53 mRNA并且对于p53的翻译蛋白合成起到了促进作用。在以往,化疗药物顺铂在肿瘤细胞及正常细胞中所诱导的p53蛋白的表达情况得到广泛的研究。作为最为重要的抑癌基因p53在肿瘤的生物治疗中是最常被干预也是最常发生突变的基因,在众多的p53野生型细胞中,化疗药物作用后导致其p53的激活表达从而导致细胞周期停止或凋亡。目前关于p53的反义转录本在化疗药物作用后的相关表达情况以及对于p53的作用研究较少。骨科常见的骨肉瘤细胞株:U-2OS和HOS是研究较多的两株细胞,其中,U-2OS是p53野生型,HOS为p53突变型。本文就这两株细胞在化疗药物顺铂处理后,wrap53及p53的表达情况进行各种检测,以研究骨肉瘤细胞在顺铂处理后后wrap53和p53基因的表达情况以及该正反以转录本之间的关系。方法:应用RT-PCR克隆两株骨肉瘤细胞的wrap53和p53基因,采用MTT法检测顺铂对于两株骨肉细胞的毒性,Real-Time PCR检测wrap53和p53基因在化疗药物顺铂以及siwrap53+顺铂处理后p53的表达水平变化情况。Western blot检测两株细胞相应的不同处理因素后的p53蛋白表达情况。结果:基因测序发现,在HOS细胞株中p53基因的DNA结合区域存在点突变。运用定量PCR分析显示p53突变骨肉瘤细胞株HOS中wrap53和p53的基础表达量远高于p53野生型细胞株U-2OS。运用MTT法检测顺铂细胞毒性显示:U-2OS细胞对化疗药物顺铂的敏感性高于HOS细胞。用定量PCR分析显示wrap53的mRNA水平在5μM到20μM浓度顺铂处理后出现浓度依赖性的表达升高,而p53的mRNA的转录水平也出现大约两倍的升高,而进一步的运用siRNA敲除wrap53后用10μM的顺铂处理后发现p53的mRNA水平相对于只用化疗药物处理组最高可以降低50%,且相对应的蛋白水平也出现明显的降低。在HOS细胞株中,单独运用顺铂也可以引起wrap53的mRNA表达水平的升高,但p53的mRNA及蛋白水平升高不明显,单独siRNA处理HOS细胞后,p53的mRNA水平升高约30%,但是在联合应用10μM的顺铂处理后,p53的mRNA水平相对于只用化疗药物处理组降低约40%,相应的p53蛋白水平也有所降低。结论:在U-2OS和HOS这两株细胞中,wrap53和p53基础表达量相差较大,在U-2OS中,CDDP激活p53的表达需要wrap53的mRNA水平增加。但是在HOS细胞中顺铂引起的wrap53 mRNA水平提高在p53表达激活中没有明显的作用,wrap53的敲除可以使顺铂引起的p53激活作用减弱。以上结果说明,在这两株p53状态不同的骨肉瘤细胞株中,wrap53在顺铂所诱导的p53激活作用中所起的作用不完全相同,这可能与细胞的本身遗传特性以及基因表达量有关。这些研究为以后的骨肉瘤临床化疗以及分子生物学治疗打下了良好的基础。

全文目录


中文摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
缩略词简表  10-12
第一章 前言  12-18
  1.1 背景  12-16
    1.1.1 p53 的结构功能以及突变意义  12-13
    1.1.2 wrap53 基因的结构和与p53 的相互作用关系  13-16
    1.1.3 顺铂的化疗机理以及在骨肉瘤临床的应用  16
  1.2 本项研究课题的研究意义  16
  1.3 研究目标与研究内容  16-18
    1.3.1 研究目标  16-17
    1.3.2 研究内容  17-18
第二章 骨肉瘤细胞中wrap531α和p53 基因的克隆  18-24
  2.1 实验材料  18-19
    2.1.1 细胞来源以及菌种、质粒  18
    2.1.2 培养基  18
    2.1.3 酶、试剂盒及主要试剂  18-19
  2.2 实验方法  19-22
    2.2.1 细胞培养  19
    2.2.2 总 RNA 提取、纯度鉴定以及 RT-PCR  19-20
    2.2.3 3'-RACE  20-21
    2.2.4 DNA 测序以及序列分析  21
    2.2.5 生物信息学方法分析wrap53 和p53 序列  21-22
  2.3 结果  22-24
    2.3.1 RT-PCR 检测wrap531α  22-23
    2.3.2 PCR 产物DNA 测序结果  23-24
第三章 顺铂处理后wrap53 和p53 基因的表达情况  24-32
  3.1 材料  24
    3.1.1 细胞系  24
    3.1.2 培养基和药物  24
    3.1.3 酶、试剂盒以及主要试剂  24
  3.2 方法  24-27
    3.2.1 细胞培养和顺铂药物处理  24-25
    3.2.2 总 RNA 提取、实时荧光定量 RT-PCR  25-26
    3.2.3 蛋白电泳样品处理及 SDS-PAGE  26-27
  3.3 结果  27-32
    3.3.1 wrap53 和 p53 的 mRNA 及 p53 蛋白的本底表达量  27-28
    3.3.2 MTT 检测顺铂对 U-2OS 和 HOS 细胞的毒性  28-29
    3.3.3 不同浓度顺铂处理后 wrap53 和 p53 基因的表达情况  29-30
    3.3.4 wrap53 和 p53 基因在 10μM 顺铂处理不同时间后的表达情况  30-31
    3.3.5 wrap53 和 p53 在 10 μM 顺铂处理不同时间后的表达情况  31-32
第四章 讨论  32-34
  4.1 U-2OS 中顺铂对于 wrap53 和 p53 的调节  32
  4.2 HOS 细胞中 wrap53 对于 p53 的调节  32-33
  4.3 结论  33-34
参考文献  34-37
附件 综述  37-44
  参考文献  42-44
硕士期间发表论文情况  44-45
致谢  45-46
个人简介  46

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 运动系肿瘤 > 骨骼肿瘤
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