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微氧发酵制备1，3-丙二醇及其代谢流量分析

作　者: 王元好
导　师: 修志龙
学　校: 大连理工大学
专　业: 生物化工
关键词: 1，3-丙二醇克雷伯氏菌高效液相色谱微氧发酵代谢流量流加连续串联发酵
分类号: TQ923
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

1,3-丙二醇(1,3-Propanediol,1,3-PD)是一种重要的化工原料,其最主要的用途是作为单体合成新型聚酯材料—聚对苯二甲酸丙二酯(PTT),市场前景广阔。目前,1,3-PD的生产方法以化学法为主,但是随着石化资源日益枯竭及其价格的不断上升,以可再生资源为原料、低污染、可持续发展的生物法生产1,3-PD越来越引起人们的高度重视。其中研究最多的是利用克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)以甘油为底物发酵生产1,3-PD。目前多采用厌氧发酵模式,存在产物浓度低、发酵周期长、生产强度低的缺点。而微氧发酵可以促进菌体生长,缩短生长周期,提高生产强度。本论文考察了微氧发酵模式下,不同通气条件对批式、批式流加及连续发酵过程生产1,3-PD的浓度和转化率的影响；通过代谢流量分析,考察了微氧条件下K. pneumoniae的甘油代谢机制,在此基础上,探索了微氧-厌氧连续流加甘油多罐串联发酵生产1,3-PD工艺的可行性。主要结果如下：首先,建立了快速检测分析1,3-PD发酵液中多种有机酸的高效液相色谱分析方法。采用Shodex RSpak KC-811色谱柱,15 min内就能把发酵过程中产生的9种有机酸完全分离并定量,有机酸的线性相关系数R≥0.9992,RSD为0.004～2.756%,发酵液样品中8种有机酸回收率在96.8～102.5%之间。多次重复实验证明：本方法具有灵敏度高、分析速度快、准确度高和重现性好等优点,对于及时有效地测定1,3-PD发酵液中有机酸积累情况,分析不同培养条件下K. pneumoniae菌发酵的代谢流量,指导1,3-PD发酵具有重要意义。其次,考察了批式和批式流加两种操作模式下,通气条件对微氧发酵生产1,3-PD的影响,并对K. pneumoniae对数生长期的代谢流量分布进行分析。实验结果表明,两种操作模式下的最佳通空气量均为0.04 vvm,可获得最高的1,3-PD的浓度和生产强度,转化率也与厌氧条件下接近。1,3-PD的浓度分别为17.30及57.49 g/L,生产强度分别比厌氧条件提高了13%和40%,转化率分别为0.52和0.55 mol/mol。微氧条件下批式发酵对数期代谢流量分析表明,通气量为0.04 vvm空气时,VEtOH/VHAc的比例与厌氧条件下的比例相同,均为1：3,并且在这两种条件下1,3-PD浓度相近。表明在乙酰辅酶A节点处,还原当量(NADH)与能量(ATP)的合理分配影响着1,3-PD合成。批式流加发酵对数期代谢流分析表明,四种通气条件中,厌氧条件下流入1,3-PD的代谢流量最高；而在微氧条件下,通气量为0.04 vvm空气时,进入1,3-PD的代谢流量最高,为通气量为0.08 vvm氮气条件下,进入1,3-PD的代谢流量的93%。再次,考察了连续发酵稳态操作模式下,甘油浓度和通气条件对K. pneumonia代谢的影响。重点考察了稀释速率为0.2h-1三种不同甘油浓度和四种通气条件对细胞生长、1,3-PD和副产品的生成及三个关键酶的比活力的影响。结果表明,最佳工艺条件为：初始甘油浓度70 g/L,通空气量0.04 vvm。此时,1,3-PD的浓度和转化率最高,分别为19.7g/L和0.41 mol/mol。在初始甘油浓度为20和40 g/L时,厌氧条件下1,3-PD的浓度最高。代谢流量分析表明,微氧条件下随着通气量的增加,进入生物量、乳酸和2,3-丁二醇的代谢流量增加,同时通气量的改变导致VEtOH/VHAc比例变化,从而调整NAD+和NADH平衡。因此,提高1,3-PD浓度的瓶颈不是提高NADH的总量,而是调整甘油代谢节点处代谢流量的分配。甘油脱水酶、1,3-丙二醇氧化还原酶、甘油脱水酶的比活力检测结果表明,dha操纵子在微氧条件并未受到抑制,1,3-PD的代谢调节机制的差异不仅存在于代谢水平上,还存在于基因水平上。最后,探索了微氧-厌氧联合连续流加甘油的三罐串联发酵生产1,3-PD的工艺路线。根据菌体生长及产1,3-PD特点,在第一个发酵罐中通入0.04 vvm空气,在微氧条件下发酵以促进菌体的生长,同时为了防止底物限制和过量,控制初始甘油浓度(40-110 g/L)和稀释速率(0.1～0.2h-1)；在第二个发酵罐中通入0.04vvm氮气,同进流加入甘油使残余甘油浓度处于合理范围内,在厌氧条件下,提高1,3-PD浓度和转化率；在第三个发酵罐进行厌氧培养,消耗掉残余甘油并且进一步提高1,3-PD的浓度。在这些条件下,考察了串联连续稳态发酵模式下,不同稀释速率、初始甘油浓度与残余甘油浓度对发酵不同阶段的K. pneumonia代谢生成1,3-PD的影响。实验结果表明,通过三罐串联发酵,1,3-PD浓度和生产强度均可以得到提高。初始甘油浓度为110 g/L,稀释速率为0.1h-1时,1,3-PD浓度可达最高值(46.2 g/L),但此时终产物中残余甘油浓度较高(17.2 g/L),生产强度较低(4.2 g/(L·h)),不利于工业生产。综合考虑各方面因素,选择初始甘油浓度为40 g/L,稀释速率为0.2 h-1,第二个发酵罐中甘油浓度为30.9 g/L为最佳工艺条件。该条件下,发酵液中1,3-PD浓度和生产强度分别为36.7 g/L和7.3 g/(L·h),残余甘油浓度仅为1.7 g/L。该工艺可以获得高浓度的目标产物和生产强度,最大限度地降低最终发酵液中的残余甘油浓度,既节约了资源,又降低了下游分离的能耗,为工业化生产奠定了基础。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-12
引言  12-14
1 生物法生产1,3-丙二醇及其代谢流量分析的研究进展  14-37
  1.1 1,3-丙二醇的概况  14-15
  1.2 1,3-丙二醇的生产方法  15-18
    1.2.1 化学法  16-17
    1.2.2 生物转化法  17-18
  1.3 甘油生物转化1,3-丙二醇的研究  18-32
    1.3.1 甘油生物转化1,3-丙二醇的菌种  19-20
    1.3.2 甘油生物转化1,3-丙二醇的代谢途径及关键酶  20-25
    1.3.3 K.pnuemoniae微氧发酵生产1,3-丙二醇  25-27
    1.3.4 生物法转化1,3-丙二醇的发酵优化过程与控制  27-31
    1.3.5 生物转化法生产1,3-丙二醇的下游分离过程  31-32
  1.4 代谢网络及代谢流量分析  32-35
    1.4.1 代谢工程概述  32
    1.4.2 代谢流量分析  32-34
    1.4.3 代谢流量分析方法在1,3-丙二醇发酵中的应用  34-35
  1.5 未来与展望  35
  1.6 本论文主要研究内容  35-37
2 发酵液中有机酸测定方法的确立  37-51
  2.1 引言  37-38
  2.2 材料与方法  38-42
    2.2.1 实验材料  38-39
    2.2.2 实验仪器  39-40
    2.2.3 实验菌种  40
    2.2.4 培养基配制  40-41
    2.2.5 发酵实验方法  41
    2.2.6 高效液相色谱分析实验方法  41-42
  2.3 结果与讨论  42-50
    2.3.1 流动相的选择  42-43
    2.3.2 洗脱条件的选择  43-44
    2.3.3 检测波长的选择  44
    2.3.4 柱温的选择  44-46
    2.3.5 线性回归分析与检出限  46
    2.3.6 方法的精密度实验  46-47
    2.3.7 方法的回收率测定  47
    2.3.8 1,3-丙二醇发酵液中有机酸HPLC检测分析  47-50
  2.4 小结  50-51
3 不同通气条件下批式及批式流加发酵甘油代谢流量分布  51-80
  3.1 引言  51-52
  3.2 材料与方法  52-61
    3.2.1 实验试剂  52-53
    3.2.2 实验仪器  53
    3.2.3 实验方法  53
    3.2.4 分析方法  53-61
  3.3 结果与讨论  61-79
    3.3.1 批式发酵中不同通气条件对菌体生长及产物生成的影响  61-66
    3.3.2 批式发酵中不同通气条件对代谢流量分布的影响  66-71
    3.3.3 批式流加发酵中不同通气条件对菌体生长及产物生成的影响  71-77
    3.3.4 批式流加发酵中不同通气条件对代谢流量分布的影响  77-79
  3.4 小结  79-80
4 不同甘油浓度和通气条件下连续发酵甘油代谢流量分布  80-96
  4.1 引言  80-81
  4.2 材料与方法  81-82
    4.2.1 实验试剂  81
    4.2.2 实验仪器  81
    4.2.3 实验方法  81-82
    4.2.4 分析方法  82
    4.2.5 代谢流量及碳平衡计算  82
  4.3 结果与讨论  82-94
    4.3.1 甘油浓度和通气条件对菌体生长和主要代谢产物生成的影响  82-87
    4.3.2 甘油浓度和通气条件对代谢流量的影响  87
    4.3.3 甘油浓度和通气条件对代谢节点的影响  87-92
    4.3.4 甘油浓度和通气条件对氧化还原电势的影响  92-93
    4.3.5 甘油浓度和通气条件对关键酶活力的影响  93-94
  4.4 小结  94-96
5 微氧-厌氧联合连续流加甘油多罐串联发酵生产1,3-丙二醇  96-123
  5.1 引言  96-97
  5.2 材料与方法  97-98
    5.2.1 实验试剂  97
    5.2.2 实验仪器  97
    5.2.3 实验方法  97-98
    5.2.4 分析方法  98
  5.3 结果与讨论  98-122
    5.3.1 高稀释速率下不同残余甘油浓度对转化1,3-丙二醇的影响  98-100
    5.3.2 高稀释速率下不同残余甘油浓度对关键酶活力的影响  100-102
    5.3.3 高稀释速率下不同残余甘油浓度对副产物的影响  102-103
    5.3.4 高稀释速率下不同残余甘油浓度对代谢流量分布的影响  103-108
    5.3.5 低稀释速率下不同初始甘油浓度对转化1,3-丙二醇的影响  108-110
    5.3.6 低稀释速率下不同初始甘油浓度对关键酶活力的影响  110
    5.3.7 低稀释速率下不同初始甘油浓度对副产物的影响  110-115
    5.3.8 低稀释速率下不同初始甘油浓度对代谢流量分布的影响  115-122
  5.4 小结  122-123
结论与展望  123-125
创新点摘要  125-126
参考文献  126-139
附录—符号缩写及单位  139-141
攻读博士学位期间发表学术论文情况  141-142
致谢  142-143
作者简介  143-144

微氧发酵制备1，3-丙二醇及其代谢流量分析

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