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Bcl-2抑制剂ABT-737与化疗药物联合用药的药效学及机制研究

作　者: 张翀
导　师: 杨波；何俏军
学　校: 浙江大学
专　业: 药理学
关键词: ABT-737 吉西他滨 三氧化二砷 GDC-0941 Mcl-1 细胞凋亡
分类号: R96
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


研究目的：ABT-737是类似BH-3的小分子物质,能够抑制抗凋亡的Bcl-2家族蛋白Bcl-2,Bcl-xL和Bcl-w的活性,引起凋亡蛋白t-Bid, Bad及Bim从抗凋亡蛋白中释放。ABT-737能够拮抗Bcl-2和Bcl-xL,但是和另一个抑凋亡蛋白Mcl-1的BH3结构域亲和力较小,因而某些实体瘤或白血病细胞中抑凋亡蛋白Mcl-1高表达时,造成肿瘤细胞对ABT-737耐药。本文研究了ABT-737与其他化疗药物(吉西他滨,GDC-0941及AS203)联合用药的药效学及其机制研究。研究方法：(1)MTT法检测ABT-737与化疗药物联合用药抑制人肿瘤细胞增殖。(2)利用PI单染或Annexin V/PI双染法流式细胞术检测凋亡率。(3)利用JC1染色法检测线粒体膜电位变化。(4)Western blotting法检测蛋白的表达。(5)流式细胞术检测Bax的转位。(6)荧光定量PCR法检测mRNA的表达。(7)免疫沉淀法检测蛋白与蛋白之间的关系。(8)利用SiRNA技术沉默基因表达。(9)利用质粒扩增蛋白表达。(10)建立人源性肿瘤裸小鼠移植瘤模型。研究结果：(1)吉西他滨与ABT-737联合用药的抗肿瘤药效学及其机制研究：吉西他滨与ABT-737能够协同抑制实体瘤细胞增殖,吉西他滨与ABT-737合用通过改变线粒体膜通透性,激活Caspase-3,引起PARP的切割,最终诱导95-D肺癌细胞和5637膀胱癌细胞发生凋亡。在ABT-737耐药细胞中,我们发现ABT-737能够增强去泛素蛋白USP9X与Mcl-1的结合,抑制Mcl-1的泛素化降解,最终导致Mcl-1的累积而引起ABT-737的耐药,而吉西他滨可以破坏USP9X与Mcl-1的链接,增加Mcl-1的泛素化水平,引起Mcl-1的大量泛素化,最终引起两药发生协同效果。同时在人肺癌95-D移植瘤裸小鼠模型及原代病人细胞上,吉西他滨与ABT-737也能协同抑制肿瘤细胞的增殖。(2)GDC-0941与ABT-737联合用药的抗肿瘤药效学及其机制研究：GDC-0941与ABT-737能够协同抑制乳腺癌细胞增殖,GDC-0941与ABT-737合用通过改变线粒体膜通透性,激活Caspase-3,引起PARP的切割,最终诱导MDA-MB-231细胞和SKBR3细胞发生凋亡。此外,GDC-0941能够促进Mcl-1蛋白的泛素化降解,从而引起两药发生协同效果。同时在人乳腺癌MDA-MB-231移植瘤裸小鼠模型上,GDC-0941与ABT-737也能协同抑制肿瘤细胞的增殖。(3)三氧化二砷与ABT-737联合用药的抗肿瘤药效学及其机制研究：三氧化二砷与ABT-737能够协同抑制白血病细胞增殖,三氧化二砷与ABT-737合用通过改变线粒体膜通透性,最终诱导白血病细胞发生凋亡。此外,三氧化二砷与ABT-737合用能够显著下调Caspase-8、Caspase-3、Bid等蛋白水平,并伴随有DNA修复蛋白PARP、Caspase-8和Caspase-3裂解片段的出现和累积。结论：(1)吉西他滨与ABT-737合用是通过破坏USP9X与Mcl-1的链接,导致Mcl-1大量泛素化降解,诱导实体瘤细胞发生凋亡,实现协同抑制肿瘤作用。(2)GDC-0941与ABT-737合用是通过降解Mc-1,诱导乳腺癌细胞发生凋亡,实现协同抗肿瘤作用。(3)三氧化二砷能够与ABT-737协同诱导白血病细胞发生凋亡,最终实现协同抗肿瘤作用。

全文目录


致谢  5-6
中文摘要  6-8
英文摘要  8-11
目次  11-15
前言  15-19
第一部分吉西他滨与ABT-737合用的药效学及其机制研究  19-63
  1.1 实验仪器与材料  20-23
  1.2 实验方法  23-30
    1.2.1 肿瘤细胞常规培养  23
    1.2.2 MTT染色法测定吉西他滨与ABT-737合用作用于肿瘤细胞的增殖情况  23
    1.2.3 流式细胞术测定细胞凋亡  23-24
    1.2.4 JC1染色测定线粒体膜电位变化  24
    1.2.5 Western blotting法检测蛋白表达  24-27
    1.2.6 实时荧光定量PCR法测定Mcl-1及USP9X基因转录水平  27-28
    1.2.7 免疫沉淀法  28-29
    1.2.8 SiRNA技术沉默95-D细胞的Mcl-1和USP9X  29
    1.2.9 人高转移肺癌95-D裸小鼠移植瘤模型的建立及实验治疗作用  29-30
    1.2.10 数据分析  30
  1.3 实验结果  30-57
    1.3.1 吉西他滨与ABT-737合用体外抑制实体瘤细胞增殖的影响  30-37
    1.3.2 流式细胞术检测吉西他滨与ABT-737诱导95-D与5637细胞凋亡  37-38
    1.3.3 流式细胞术检测吉西他滨与ABT-737对95-D与5637线粒体膜电位水平的影响  38-41
    1.3.4 检测吉西他滨与ABT-737协同诱导实体瘤细胞凋亡通路相关蛋白表达  41-42
    1.3.5 吉西他滨与ABT-737合用诱导Bax蛋白转位  42-43
    1.3.6 吉西他滨与ABT-737合用诱导的肿瘤细胞凋亡是Caspase依赖  43-44
    1.3.7 吉西他滨与ABT-737合用激活泛素-蛋白酶体降解通路,并且促进Mcl-1蛋白的降解  44-46
    1.3.8 ABT-737调控耐药基因Mcl-1,USP9X的表达  46-49
    1.3.9 吉西他滨通过抑制Mcl-1与USP9X的结合促进Mcl-1的降解  49-52
    1.3.10 吉西他滨与ABT-737合用对人高转移肺癌95-D裸小鼠移植瘤的试验治疗作用  52-55
    1.3.11 吉西他滨与ABT-737合用协同抑制人原代肾癌细胞增殖  55-57
  1.4 讨论  57-63
第二部分 GDC-0941与ABT-737合用抑制乳腺癌的药效学及其机制研究  63-97
  2.1 实验仪器与材料  64-66
  2.2 实验方法  66-75
    2.2.1 肿瘤细胞常规培养  66-67
    2.2.2 MTT染色法测定GDC-0941与ABT-737合用作用于乳腺瘤细胞的增殖情况  67
    2.2.3 流式细胞术测定细胞凋亡  67-68
    2.2.4 JC1染色测定线粒体膜电位变化  68
    2.2.5 Western blotting法检测蛋白含量  68-70
    2.2.6 实时荧光定量PCR法测定Mcl-1基因转录水平  70-71
    2.2.7 SiRNA技术沉默MDA-MB-231细胞的Mcl-1  71-72
    2.2.8 质粒转染MDA-MB-231细胞高表达Mcl-1蛋白  72
    2.2.9 人乳腺癌细胞MDA-MB-231裸小鼠移植瘤模型的建立及实验治疗作用  72-73
    2.2.10 瘤组织苏木素&伊红染色法(H&E染色)  73-74
    2.2.11 瘤组织TUNEL染色检测凋亡情况  74-75
    2.2.12 数据分析  75
  2.3 实验结果  75-95
    2.3.1 GDC-0941与ABT-737合用体外对乳腺瘤细胞增殖的影响  75-79
    2.3.2 流式细胞术检测GDC-0941与ABT-737诱导MDA-MB-231与SKBR3细胞凋亡  79-80
    2.3.3 流式细胞术检测GDC-0941与ABT-737对MDA-MB-231与SKBR3线粒体膜电位水平的影响  80-81
    2.3.4 检测GDC-0941与ABT-737协同诱导乳腺癌细胞凋亡通路相关蛋白表达  81-83
    2.3.5 GDC-0941与ABT-737合用诱导的肿瘤细胞凋亡是Caspase依赖  83
    2.3.6 GDC-0941通过激活泛素-蛋白酶体降解通路促进Mcl-1蛋白的降解  83-86
    2.3.7 Mcl-1在GDC-0941与ABT-737合用中发挥的作用  86-90
    2.3.8 GDC-0941与ABT-737合用对人乳腺癌MDA-MB-231裸小鼠移植瘤的试验治疗作用  90-95
  2.4 讨论  95-97
第三部分 AN_2O_3与ABT-737合用抑制白血病细胞的药效学及其机制研究  97-119
  3.1 实验仪器与材料  98-100
  3.2 实验方法  100-104
    3.2.1 肿瘤细胞培养  100
    3.2.2 CCK8法检测As_2O_3与ABT-737对白血病细胞的存活率影响  100-101
    3.2.3 PI单染法检测As_2O_3与ABT-737诱导白血病细胞凋亡  101
    3.2.4 JC-1法检测As_2O_3与ABT-737对细胞内线粒体膜电位的影响  101
    3.2.5 Western Blotting检测ABT-737与As_2O_3诱导白血病细胞凋亡通路相关蛋白表达  101-103
    3.2.6 数据分析方法  103-104
  3.3 实验结果  104-115
    3.3.1 检测As_2O_3与ABT-737作用不同白血病细胞存活率的影响  104-105
    3.3.2 检测As_2O_3与ABT-737作用于不同白血病细胞中的合用指数  105-108
    3.3.3 流式细胞术检测As_2O_3与ABT-737诱导白血病细胞凋亡  108-109
    3.3.4 As_2O_3与ABT-737对白血病细胞内线粒体膜电位水平的影响  109-110
    3.3.5 As_2O_3与ABT-737协同诱导白血病细胞凋亡呈现时间与剂量依赖关系  110-114
    3.3.6 检测As_2O_3与ABT-737协同诱导白血病细胞凋亡通路相关蛋白表达  114-115
  3.4 讨论  115-119
总结与展望  119-120
参考文献  120-127
综述  127-144
  参考文献  138-144
作者简历及在读期间所取得的科研成果  144
博士在读期间所获科研成果情况  144-145

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学
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