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面向靛玉红生物制备的细胞色素P450 BM-3半理性定向进化

作　者: 胡升
导　师: 梅乐和
学　校: 浙江大学
专　业: 生物化工
关键词: 靛玉红 P450 BM-3 半理性定向进化吲哚羟基化区域选择性
分类号: Q559.9
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

采用蛋白质工程手段对酶进行改造、使其具备特定的性质,常常是利用酶进行生物催化与生物转化的前提。为了获得催化吲哚羟基化时以靛玉红为主要产物的生物催化剂、满足靛玉红生物制备的需要,本论文采用半理性定向进化手段对细胞色素P450 BM-3进行了改造,改变了该酶催化吲哚羟基化时以靛蓝为主产物的性质,得到了一个以靛玉红为反应主产物的突变酶,为利用P450 BM-3进行靛玉红的生物制备创造了条件。论文同时对所得突变酶的催化性质、该突变酶催化吲哚羟基化的反应过程和靛玉红生成机理进行了研究,分析了突变酶以靛玉红为反应主产物的分子机制,讨论了与此相关的P450 BM-3的结构-功能关系。首先,采用半理性定向进化思想,基于对已有P450 BM-3定向进化研究结果的分析,选择以P450 BM-3(A74G/F87V/L188Q/E435T)为亲本、以D168位点为靶点进行了定点饱和突变,构建了饱和突变文库。在96孔板中进行了突变文库的筛选,包括培养工程菌、诱导突变酶的表达、进行吲哚的羟基化反应和萃取产物等过程。然后根据所得产物的颜色和组成,从突变文库中获得了一个催化产物为红色、催化产物组成以靛玉红为主的突变酶D168W。经高效液相色谱分析,该突变酶的吲哚羟基化产物中,靛玉红的含量是靛蓝含量的9倍。其后,对该突变酶D168W的酶学性质进行了考察,测定了酶的动力学参数,考察了其催化活力与pH值和温度的关系,确定了最适反应条件。研究发现,D168W突变虽然使靛玉红成为了吲哚羟基化反应的主产物,但该突变不仅降低了酶对于吲哚的亲和力(Km比亲本增大3.7倍),同时也降低了电子耦合效率。之后,对突变酶D168W催化吲哚羟基化的反应过程进行了监测,研究该酶催化合成靛玉红的可能反应途径和机理。结果发现,该酶在催化吲哚羟基化时,主要的直接羟基化产物是通过C-2位羟基化产生的2-羟吲哚。虽然靛红在吲哚羟基化的早期就已产生这一现象说明突变酶能同时催化C-3位的羟基化,但可以推断,D168W催化吲哚羟基化时偏向于发生C-2的羟基化。靛玉红有可能来自靛红与3-羟吲哚的反应,也有可能来自2-羟吲哚与3-羟吲哚的反应。D168W突变酶对吲哚的转化率较低,只有不到25%的吲哚被转化为各种羟基化产物。这与在酶学性质考察中发现D168W突变降低了酶对吲哚的亲和力的现象是一致的。最后,采用分子模拟和分子对接计算程序,对D168W突变酶催化吲哚反应的羟基化区域选择性进行了考察。结果发现,D168W突变改变了酶催化吲哚的区域选择性,使吲哚的C-2比C-3更接近于酶的活性中心,从而从分子水平上解释了靛玉红成为主产物的原因。此外,还对D168W突变改变酶区域选择性的机理进行了分析,提出了一个可能的原因,即D168W突变改变了一个与底物通道有关的α-螺旋在空间的取向,从而间接影响了底物通道的构成、并最终改变了吲哚与P450 BM-3结合时的空间取向,导致羟基化位点选择性发生改变。课题研究以靛玉红的生物制备为目标对P450 BM-3这一极具应用潜力的羟基化酶进行了半理性定向进化。由于根据对已有P450 BM-3定向进化研究结果的分析,选择了特定的位点进行定点饱和突变,因此通过一次突变-筛选就从400多个突变中获得了具备目的表型的突变酶。研究不仅获得了催化吲哚时以靛玉红为主要产物的突变酶、为靛玉红的生物制备创造了条件,而且还对靛玉红的形成机理进行了考察,并从分子水平解释了氨基酸残基突变改变产物组成的原因,丰富了对P450 BM-3结构-功能关系的了解。

全文目录

致谢  6-9
摘要  9-11
Abstract  11-13
目录  13-16
第一章绪论  16-43
  1.1 引言  16-18
  1.2 定向进化  18-35
    1.2.1 定向进化简介  18-21
    1.2.2 半理性定向进化  21-35
  1.3 靛玉红的生物制备  35-39
    1.3.1 靛玉红生物制备的意义  35-36
    1.3.2 目前靛玉红生物制备尚存在的问题  36-39
  1.4 P450 BM-3的定向进化研究  39-40
  1.5 课题的研究目的和内容  40-43
    1.5.1 研究目标和内容  40-41
    1.5.2 研究方法、技术路线和实验方案  41-43
第二章 P450 BM-3饱和突变文库的构建及筛选  43-60
  2.1 引言  43-44
  2.2 材料与仪器  44-46
    2.2.1 宿主菌和质粒  44-45
    2.2.2 酶及分子生物学试剂  45
    2.2.3 化学试剂  45
    2.2.4 培养基配方  45-46
    2.2.5 实验仪器  46
  2.3 实验方法  46-49
    2.3.1 大肠杆菌质粒的提取  46-47
    2.3.2 大肠杆菌CaCl_2感受态细胞的制备  47
    2.3.3 饱和突变文库构建  47-48
    2.3.4 饱和突变文库筛选  48
    2.3.5 突变酶序列测定  48-49
  2.4 结果与讨论  49-58
    2.4.1 定点饱和突变文库构建  49-52
    2.4.2 定点饱和突变文库筛选  52-58
    2.4.3 DNA测序  58
  2.5 本章小结  58-60
第三章 D168W突变酶的酶学性质研究  60-71
  3.1 引言  60
  3.2 材料与方法  60-63
    3.2.1 试剂与材料  60
    3.2.2 实验仪器  60
    3.2.3 实验方法  60-63
  3.3 结果与讨论  63-70
    3.3.1 突变酶P450 BM-3的分离纯化  63-66
    3.3.2 突变酶催化活力及动力学特征分析  66-68
    3.3.4 突变酶电子耦合率分析  68
    3.3.5 突变酶催化产物组成测定  68
    3.3.6 pH对突变酶羟基化反应的影响  68-69
    3.3.7 突变酶热稳定性测定  69-70
  3.4 本章小结  70-71
第四章突变酶催化吲哚羟基化产生靛玉红的机理分析  71-84
  4.1 引言  71
  4.2 试剂与器材  71-72
    4.2.1 质粒与菌株  71
    4.2.2 分子生物学及化学试剂  71-72
    4.2.3 培养基  72
    4.2.4 实验仪器  72
    4.2.5 蛋白质模拟和分子对接软件  72
  4.3 实验方法  72-74
    4.3.1 P450 BM-3突变酶的表达和制备  72
    4.3.2 吲哚羟基化反应过程监测  72
    4.3.3 高效液相色谱(HPLC)分析  72-73
    4.3.4 突变酶三维建模及其与吲哚对接分析  73-74
  4.4 结果与讨论  74-82
    4.4.1 D168W突变酶制备  74
    4.4.2 HPLC检测条件的确定  74-75
    4.4.3 突变酶D168W催化吲哚羟基化的机理分析  75-77
    4.4.4 酶与吲哚作用关系分析  77-82
  4.5 小结  82-84
第五章结论与展望  84-87
  5.1 结论  84-85
  5.2 展望  85-87
参考文献  87-102
作者简历  102-103
在学期间的科研成果  103

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