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DNA电化学活性—非活性转换分子信标的制备及其应用研究

作　者: 张帆
导　师: 程圭芳；何品刚；方禹之
学　校: 华东师范大学
专　业: 分析化学
关键词: DNA 电化学分子信标胭脂红酸活性-非活性分子转换纳米金颗粒单碱基错配
分类号: Q523
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

随着基因结构与基因功能研究的不断深入,特别是“人类基因组项目”的完成,人类疾病的DNA诊断及基因治疗的研究正进入一个新的纪元,而研究的基础,很大一部分在于对致病基因序列的识别以及确定。传统的DNA序列测定法消耗时间长,劳动强度大;而新兴的以Watson-Crick碱基互补配对原则为基础的DNA生物传感器为分子生物学研究提供了全新的基因检测技术。其中,建立在DNA分子杂交基础上的DNA生物传感器,与一些新的标记方法如荧光法、化学发光法和电化学法等相结合,使DNA传感器既免去了放射性标记对人体的危害以及昂贵的价格,又节省了传统方法操作花费的时间,具有操作简便、快速灵敏、特异性好和无污染等特点,并且具有分子识别、分离纯化基因等功能。对此类DNA生物传感器的研究现已成为基因研究中最具有吸引力的前沿课题之一。本论文的创新之处有二:首先,分子信标技术优化了DNA链,设计为分子信标构型的DNA链,其特殊的“发卡”结构使得单纯基于DNA杂交基础上的分子探针,在检测之前多了一个使“发卡”打开后再与目标分子进行杂交的这样一个过程,从而在一定程度上增加了杂交反应发生的难度;而纳米金颗粒的引入,由于其对单链DNA的吸附作用,在杂交反应的同时增加一个脱附的过程,进一步加大了杂交反应的发生难度,这两项技术都大大提高了DNA分子信标的特异性;其次,本论文设计了一种新型的电化学分子信标模型,它不同于传统的、一端组装在电极表面的电化学分子信标。传统的分子信标是通过检测分子信标杂交前后,由于构型变化而引起的连接在其末端信号分子与电极表面距离的变化,从而导致的电化学信号的差异来间接进行目标分子的检测。论文中使用的新型电化学分子信标是非固定型的,完全在溶液中而不是在电极表面进行杂交反应。其信号的发生是基于分子的电化学活性-非活性转换来实现的:它们在分子信标闭合状态下没有电化学活性,而当分子信标打开之后,则可以表现出电化学活性。这种类型的电化学信标既有荧光分子信标简便快捷、易控制的特点,又有成本廉价、易于改装成小型化的便携装置的独特优势,目前尚未见有类似报道。论文分为四章:第一章:绪论首先,介绍了DNA电化学生物传感器,着重介绍了DNA电化学检测。接着介绍了分子信标技术,从荧光分子信标和电化学分子信标两个方面,分别对近年来分子信标检测目标分子的原理、方法、应用及发展趋势等方面做了综述;并对纳米金颗粒的特性及在生物分析中的应用作了简介。最后阐述了本论文的目的意义及创新之处。第二章:新型电化学活性-非活性转换分子信标的研制及其应用本章中,首先提出了一种基于电化学活性-非活性分子转换的新型分子信标。此类分子信标本身在实验选定条件下无电化学信号,与完全互补序列杂交后产生电化学信号,论文采用碳纳米管修饰电极对杂交前后的电化学信号进行检测。实验发现该分子信标的电化学信号强度与完全互补序列的浓度在(6.0×10^-8mol/L-1.4×10^-6mol/L)范围内成线性关系,相关系数为0.9972,检出限为1×10^-8mol/L;其中,完全非互补序列的电化学响应信号与空白信号基本相同,且对一、二、三碱基错配序列的响应信号与完全互补序列的响应信号差别明显,表明分子信标可以实现对目标DNA的定量检测和在一定程度上鉴别碱基错配。第三章:基于纳米金颗粒的高特异性DNA电化学活性.非活性转换分子信标体系的研制及其应用本章通过柠檬酸三钠还原氯金酸的方法制备纳米金颗粒,利用其与单链DNA和双链DNA的不同相互作用,构建高特异性的DNA电化学分子信标。实验发现,完全非互补序列的电化学响应信号与空白信号基本相同,完全互补序列与一、二、三碱基错配序列电化学响应差别明显,且单碱基错配序列的电化学响应信号仅为完全互补序列的10%左右,与以往的方法相比,二者的电信号差别明显扩大。这说明纳米金颗粒与单链DNA和双链DNA的不同相互作用大大提高了杂交反应的特异性,完全有可能实现对单碱基突变基因片段的检测,为临床医学诊断提供了一种行之有效的突变基因检测方法。第四章:纳米金颗粒增强DNA电化学活性-非活性转换分子信标特异性的作用机理研究本章运用电化学方法对纳米金颗粒提高DNA检测特异性的机理进行了更深一步的考察研究。实验发现,纳米金颗粒与单链DNA的结合力确实远高于双链DNA,并且认为分子信标环状部分的单链DNA序列与其完全互补DNA序列形成双链DNA的作用力要强于分子信标与纳米金颗粒之间的作用力。另外,分子信标的识别能力还与错配碱基的类型及在分子信标中的位点有关。该方法对核酸特定顺序的测定及基因突变的检测提供了新的理论依据。

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论文摘要  6-9
ABSTRACT  9-13
第一章绪论  13-37
  一、 DNA 电化学生物传感器  13-18
  二、分子信标技术及其原理  18-25
  三、纳米金颗粒在生物传感器中的应用  25-31
  四、本论文的目的和意义  31-32
  参考文献  32-37
第二章新型电化学活性-非活性转换分子信标的研制及其应用  37-51
  一、引言  37-39
  二、实验部分  39-41
  三、结果与讨论  41-49
  四、结论  49
  参考文献  49-51
第三章基于纳米金颗粒的高特异性 DNA电化学活性-非活性转换分子信标体系的研制及其应用  51-65
  一、引言  51-53
  二、实验部分  53-55
  三、结果与讨论  55-62
  四、结论  62-63
  参考文献  63-65
第四章纳米金颗粒增强 DNA电化学活性-非活性转换分子信标特异性的作用机理研究  65-77
  一、引言  65-67
  二、实验部分  67-69
  三、结果与讨论  69-74
  四、结论  74-75
  参考文献  75-77
附录  77-78
致谢  78

DNA电化学活性—非活性转换分子信标的制备及其应用研究

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