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载三种不同中药磷酸钙的制备及生物学性能评价

作　者: 常立娜
导　师: 屈树新
学　校: 西南交通大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 羟基磷灰石磷酸钙骨水泥黄芪多糖柚皮苷丹酚酸B 生物相容性
分类号: TQ460.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

磷酸钙盐是构成人体硬组织的主要无机成分,同时也是优良的药物载体材料,具有良好的生物相容性、骨传导性,并能够与骨组织形成键性结合,最具有代表性的是羟基磷灰石(Hydroxyapatite, HA)和具有生物活性的磷酸钙骨水泥(Calcium phosphate cement, CPC)。然而,磷酸钙生物材料对新骨长入的引导能力有限,因此常通过在磷酸钙生物材料中添加一定的药物或生物因子等促进骨愈合。已有大量关于磷酸钙加载药物的报道。而在我国传统中医学中常用中药促进骨骼的愈合,近年来已有通过磷酸钙加载中药的报道,本课题组前期也对加载中药丹参的磷酸钙生物材料的研制、表征和药物释放进行了相应的研究。而骨科疾病的治疗中常需要多种药物的参与,因此,本文根据中医理论,从活血化瘀、补肾益气和健骨的角度分别选择三种中药提取物丹酚酸B(Sal B)、黄芪多糖(APS)和柚皮苷(Naringin),并选取HA和CPC为载体分别加载三种药物进行研究。由于所选药物为中药提取物,关于中药的有效成分、作用于细胞的有效浓度范围、HA和CPC中的药物载入量、对细胞相容性和载药CPC的体内成骨作用等都需要进一步研究。采用室温湿法合成载不同浓度APS、Naringin和Sal B的HA(HA/APS、HA/Naringin和HA/Sal B),通过X射线衍射(XRD)表征药物的载入对HA晶体结构、结晶度及晶粒尺寸的影响；激光粒度仪和比表面积仪分别检测HA的粒度及比表面积；体外培养MC3T3-E1成骨细胞,进行Alamar Blue、噻唑蓝(MTT)、碱性磷酸酶(ALP)检测,光镜或扫描电镜观察细胞形貌,研究APS、Naringin和Sal B对成骨细胞作用的有效浓度范围及HA/APS、Naringin和HA/Sal B对成骨细胞活性、增殖、碱性磷酸酶及形貌的影响。空白和载药HA与α-TCP粉分别按1：1质量比混合,固液比1g:0.6 ml,制备载三种中药磷酸钙骨水泥(CPC/APS、CPC/Naringin和CPC/Sal B),考察CPC水化前后的晶体结构、凝结时间及抗压强度；Alamar Blue检测体外培养成骨细胞的活性；将载药CPC植入兔子股骨,分别于术后2周、4周、8周取材,观察动物饮食及活动情况,X光片、组织学HE和Masson染色观察空白及载药CPC体内成骨过程。研究结果表明：HA平均粒径为1.17μm；比表面积为132.194m2/g。在本研究的载中药的量：APS:100-600μg、Naringin:100-400μg和Sal B:50-200μg, APS、Naringin和Sal B的载入对HA晶体结构、结晶度和晶粒尺寸没有明显影响；药物浓度的细胞试验表明APS和Naringin对成骨细胞的作用呈剂量和时间依赖关系,APS浓度80-200μg/mL, Naringin浓度为50-150μg/mL增强细胞活性,但Sal B没有明显影响；成骨细胞形态均完好。HA/APS、HA/Naringin和HA/Sal B促进细胞活性、增殖及碱性磷酸酶,且细胞形态完好,以HA/APS效果最为明显。载不同药物CPC的研究结果：Naringin和Sal B的载入不影响α-TCP向CPC的转化,APS对β-TCP向CPC的转化有一定的阻碍作用；合成的CPC抗压强度较低；初凝时间在5 min、终凝时间在13 min左右；细胞实验显示细胞活性增强,CPC/APS主要在早期、CPC/Naringin和CPC/Sal B在培养早期及晚期对成骨细胞生长产生促进作用；动物体内植入实验表明,植入早期,动物活动及饮食减少,之后恢复正常；X光片可见缺损处随时间的增加逐渐愈合；组织学HE染色显示样品的植入促进骨愈合,CPC/APS和CPC/Naringine在体内引起了一定炎症反应,但对骨修复没有影响,CPC/SalB尚未观察到有炎症的产生；Masson染色结果显示药物的载入促使成骨细胞活跃,分泌胶原量增加,以植入两周时最为明显,随时间的延长,骨缺损逐渐修复,与HE结果相吻合。本论文制备的载三种不同中药的磷酸钙材料,促进细胞活性、增殖及分化的作用,同时具有一定的促进骨缺损修复的作用具有剂量和时间依赖关系,为进一步研究磷酸钙载中药治疗骨缺损提供基础,载中药CPC具有作为临床骨缺损填充材料的潜能。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-15
第1章绪论  15-26
  1.1 前言  15
  1.2 磷酸钙生物材料  15-19
    1.2.1 羟基磷灰石  16
    1.2.2 磷酸钙骨水泥  16-19
  1.3 中药的研究  19-21
    1.3.1 中药在骨科方面的应用  19-20
    1.3.2 中药的作用机理  20-21
  1.4 药物的选取  21-22
    1.4.1 补肾益气中药黄芪  21
    1.4.2 补骨中药骨碎补  21-22
    1.4.3 活血化瘀中药丹参  22
  1.5 载药磷酸钙的研究  22-23
    1.5.1 HA作为药物载体的研究  22-23
    1.5.2 CPC作为药物载体的研究  23
  1.6 本课题组的前期研究  23-24
  1.7 本课题的研究内容  24-26
    1.7.1 本课题的提出及需解决的问题  24
    1.7.2 本课题的研究目的、主要内容  24-26
第2章中药成分检测及有效浓度范围的确定  26-40
  2.1 前言  26-27
  2.2 材料和方法  27-30
    2.2.1 主要试剂  27
    2.2.2 药物的最大紫外吸收峰  27
    2.2.3 三种药物紫外吸收标准曲线  27-28
    2.2.4 体外细胞培养  28-30
  2.3 结果及讨论  30-39
    2.3.1 紫外吸收峰  30-31
    2.3.2 药物紫外吸收标准曲线  31-32
    2.3.3 药物的细胞相容性  32-39
  2.4 小结  39-40
第3章载三种不同中药羟基磷灰石的制备及生物学评价  40-55
  3.1 前言  40-41
  3.2 材料和方法  41-45
    3.2.1 主要试剂  41
    3.2.2 室温湿法合成HA  41-43
    3.2.3 HA的比表面积  43
    3.2.4 HA粒度  43
    3.2.5 载药HA的X射线衍射(XRD)检测  43
    3.2.6 计算载药HA的结晶度及晶粒尺寸  43-44
    3.2.7 载药HA的细胞相容性  44-45
  3.3 结果和讨论  45-54
    3.3.1 合成HA的比表面积  45-46
    3.3.2 合成HA的粒度  46
    3.3.4 载药HA的XRD  46-47
    3.3.5 HA/APS、HA/Naringin和HA/Sal B的结晶度及晶粒尺寸  47-48
    3.3.6 HA的细胞相容性  48-54
  3.4 小结  54-55
第4章载三种不同中药磷酸钙骨水泥的制备及生物学评价  55-74
  4.1 前言  55
  4.2 材料和方法  55-60
    4.2.1 主要材料及试剂  55-56
    4.2.2 磷酸钙骨水泥的制备  56
    4.2.3 水化前及水化24、48后XRD检测结果  56
    4.2.4 CPC初、终凝时间测定  56-57
    4.2.5 CPC抗压强度测定  57
    4.2.6 细胞培养  57
    4.2.7 动物实验  57-60
  4.3 结果及讨论  60-73
    4.3.1 水化前及水化24、48 h XRD结果  60-62
    4.3.2 初,终凝时间测定  62-63
    4.3.3 抗压强度  63-64
    4.3.4 Alamar Blue检测细胞活力  64-65
    4.3.5 动物实验  65-73
  4.4 小结  73-74
结论  74-75
致谢  75-76
参考文献  76-84
攻读硕士学位期间发表的论文及科研成果  84-85
简写附录  85

载三种不同中药磷酸钙的制备及生物学性能评价

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