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家蚕VB6代谢中两个关键酶cDNA克隆、原核表达、酶学鉴定及基因结构研究

作　者: 石瑞君
导　师: 黄龙全
学　校: 安徽农业大学
专　业: 生物物理学
关键词: 吡哆醛激酶磷酸吡哆醇氧化酶家蚕基因组数据库磷酸吡哆醛维生素B6代谢
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

维生素B6是一类化合物的总称,包括吡哆醇（Pyridoxine,PN）、吡哆胺（Pyridoxine,PM）、吡哆醛（Pyridoxal,PL）,及三者相应的磷酸酯形式,磷酸吡哆醇（Pyridoxine-5’-phosphate,PNP）、磷酸吡哆胺（Pyridoxine-5’-phosphate,PMP）、磷酸吡哆醛（Pyridoxal-5’-phosphate,PLP）。PLP是细胞中一百多种酶的辅酶,这些酶大多涉及氨基酸代谢中的催化过程。同时PLP还与细胞其他多种生理活动相关,、在细胞中具有很多重要功能。植物和许多微生物能够从小分子代谢物从头合成PLP供机体需要。自然界中存在两种PLP从头合成途径,一种与PdxA及PdxJ相关,另一种与PDX1及PDX2相关。哺乳动物中没有PLP从头合成途径,需从食物中获得VB6前体（PN、PL、PM）通过补救合成途径来合成PLP。实际上,在细菌和真核生物细胞中都普遍存在一条相似的合成PLP的补救途径。这条补救代谢途径涉及不同VB6化合物间的相互转变,吡哆醛激酶（Pyridoxal kinase,PLK）、磷酸毗哆醇氧化酶（Pyridoxine 5’-phosphate oxidase,PNPO）及VB6磷酸酶在此条途径中起主要作用。在Zn²⁺和ATP存在下,PLK催化PN、PM、PL的各自磷酸化反应,生成PNP、PMP、PLP。在FMN和O₂存在下,PNPO催化PNP或PMP的氧化反应,生成PLP。家蚕和哺乳动物一样,不能够自身从头合成PLP,需要食物中的VB6前体来合成PLP。家蚕VB6代谢方式与哺乳动物相比存在较大差异。家蚕体内蛋白周转率高,短期内可合成大量蛋白质。维持体内PLP浓度的动态平衡的需求在家蚕中更突、出。因此,家蚕中PLK和PNPO的酶活性调节也将更明显。编码PLK和PNPO的cDNA或基因已从哺乳动物、植物和几种微生物中鉴定出来。昆虫中未见有克隆PLK及PNPO的报道。本研究中,利用家蚕基因组数据库及EST库,通过生物信息学方法获得了假定的编码家蚕PLK和PNPO的cDNA。依据假定的cDNA序列设计跨编码区的引物,使用设计的引物及以家蚕脂肪体总cDNA为模板,通过RT-PCR方法分别扩增到预期的两条DNA片段。扩增产物经克隆后测序,序列结果提交至GenBank,其登录号分别为DQ452397（PLK）、DQ452398（PNPO）。本研究获得的PLK-cDNA含有一894 bp的完整可读框,编码一条分子量为33.1 kDa,含298个氨基酸残基的蛋白质。此蛋白质与人的PLK序列同一性为52.84%,包含吡哆醛激酶共有的特征保守序列,但其氨基酸残基数比哺乳动物和植物克隆到的吡哆醛激酶残基数均少10多个残基。本研究获得的PNPO-cDNA含有一771 bp的完整阅读框,编码一条分子量为29.86 kDa,含257个氨基酸残基的蛋白质。此蛋白质与人的PNPO序列同一性为51.44%,一些PNPO中保守性残基也存在于此蛋白中。在人和大肠杆菌PNPO中的几个具有重要作用的氨基酸残基在此蛋白质中被其他残基替换。克隆到的两条cDNA的ORF框分别连接入pET22b（+）构建重组表达载体,表达载体转入E.coli BL21（DE3）中,菌株经IPTG诱导培养后,高效表达出了预期分子量大小的非融合蛋白。对表达产物粗酶液进行了酶促反应,采用衍生化荧光检测法检测酶促反应产物PLP的生成量。首次采用PLK与PNPO双酶级联检测PNPO酶活。活性检测结果显示,PLK-cDNA的表达产物粗酶液具有活力为30 nmol/min/mg的吡哆醛激酶活性,PNPO-cDNA的表达产物粗酶液具有活力为17 nmol/min/mg的磷酸吡哆醇氧化酶活性。酶活实验结果证实了克隆到的两条cDNA分别编码家蚕中吡哆醛激酶和磷酸吡哆醇氧化酶。依据家蚕基因组数据库信息和PLK、PNPO的cDNA,获得了家蚕中PLK和PNPO基因区序列。家蚕PLK基因包含5个外显子和4个内含子,跨越10 kb DNA序列。家蚕PNPO基因同样包含5个外显子和4个内含子,跨越3.5 kb DNA序列。家蚕PLK和PNPO基因所有外显子/内含子交接点都遵从gt/ag剪接规则,两基因的5’端启动子调控区都发现有TATA-box和CAAT-box保守基序。在分析PNPO结构中,发现了中国家蚕基因组框架图数据库中一个重叠群末端存在连续的100bp碱基测序错误,并给予了纠正。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-11
1 文献综述  11-28
  1.1 VB6及其在生物体内的作用  11-12
  1.2 微生物和植物中的两种PLP从头合成途径  12-14
    1.2.1 与pdxA和pdxJ相关途径  12-13
    1.2.2 与PDX1和PDX2相关途径  13-14
  1.3 细胞中PLP补救合成途径及VB6化合物间的相互转变  14-15
  1.4 动物体内VB6的吸收和转换代谢  15-17
    1.4.1 哺乳动物体内VB6吸收和转换代谢  15-16
    1.4.2 家蚕体内VB6的代谢  16-17
  1.5 VB6代谢中PLK和PNPO酶学研究进展  17-25
    1.5.1 PLK的研究进展  17-20
    1.5.2 PNPO研究进展  20-25
  1.6 家蚕基因组研究  25-28
    1.6.1 日本家蚕基因组研究  25-26
    1.6.2 中国家蚕基因组研究  26
    1.6.3 国际家蚕基因组研究的合作  26-27
    1.6.4 家蚕基因组相关数据库  27-28
引言  28-30
  一、研究背景与意义  28-29
  二、研究内容  29-30
2 材料与方法  30-40
  2.1 实验材料、主要试剂及设备  30-31
    2.1.1 实验材料  30
    2.1.2 实验设备  30
    2.1.3 主要试剂  30-31
  2.2 实验方法  31-40
    2.2.1 生物信息学分析  31
    2.2.2 总RNA提取与质量鉴定  31-32
    2.2.3 RNA反转录为cDNA  32-33
    2.2.4 RT-PCR扩增验证  33-34
    2.2.5 PCR产物克隆与测序  34-35
    2.2.6 PLK和PNPO的原核表达  35-38
    2.2.7 PLK和PNPO的酶活性检测  38-40
3 结果与讨论  40-54
  3.1 PLK和PNPO的cDNA序列预测  40
  3.2 RNA检测结果  40-41
  3.3 RT-PCR扩增结果  41-42
  3.4 PLK与PNPO测序结果  42-43
  3.5 PLK与PNPO多序列比对  43-47
  3.6 PLK与PNPO进化树构建  47
  3.7 PLK与PNPO的原核表达  47-49
  3.8 PLK与PNPO酶活性测定  49-51
  3.9 PLK和PNPO基因结构  51-54
    3.9.1 PLK基因结构  51-52
    3.9.2 PNPO基因结构  52-54
4 结论  54-56
参考文献  56-66
附录A  66-68
附录B  68-70
致谢  70-71
作者简介  71
在读硕士期间发表的文章  71

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