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斑马鱼Properdin基因的鉴定、表达和功能特性

作　者: 陈家艳
导　师: 梁宇君；张士璀
学　校: 中国海洋大学
专　业: 生物工程
关键词: 替代途径补体备解素 P因子凝血酶敏感蛋白
分类号: Q75
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 22次
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内容摘要

Properdin蛋白即P因子,是补体替代激活途径中的正向调节因子,起着稳定替代途径中C3转化酶(C3bBb)的作用。为了进一步阐明Properdin的结构和功能之间的关系,探索Properdin与C3b及B因子的结合位点,我们从斑马鱼中克隆并表达了该基因,以鉴定其功能特性。Properdin基因的开放阅读框全长为1314bp,编码一条含有437个氨基酸的多肽,其前20位氨基酸为信号肽,预测分子量大小为48.2KDa,也是由6个Ⅰ型凝血酶敏感蛋白重复序列构成。Properdin成熟蛋白中有40个半胱氨酸,预测有15个二硫键形成,31和58位处氨基酸可能为二个潜在的糖基化位点。对不同物种间Properdin的蛋白序列建进化树分析,结果显示斑马鱼Properdin蛋白和其它硬骨鱼Properdin聚成一簇。不同物种的Properdin蛋白序列及结构域进行多序列比对,发现斑马鱼properdin蛋白中存在保守的氨基酸基序WXXWXXW和RXR。与人、鼠、爪蟾、虹鳟(cfp1、cfp2、cfp3)的比较发现,同源性分别为42%、41%、43%、48%、48%和49%。实时荧光定量PCR结果显示:斑马鱼Properdin直到胚胎发育到30%下包时有母源性表达,且表达量随发育进行逐渐降低,但从20体节开始,合子基因开始表达。不同组织的实时荧光定量PCR结果表明,肝脏、肠、心脏、脑、眼睛、精巢、卵巢等组织中均有表达,在肠、鳍、肌肉的表达量相对较低,精巢、肝脏、眼睛、心脏、鳍的表达量较高,其中精巢中表达最多。综上所述,斑马鱼Properdin的结构域特征与哺乳动物中该蛋白的结构域特征一样,与其在系统中的发育地位是相符的。预测的一个糖基化位点位于Cys45和Cys63之间,而这两个半胱氨酸预测会形成二硫键,因此推测此二硫键为与糖类的结合位点。Properdin有母源性表达,可能提示其在发育早期起作用。不同物种间Properdin表达部位不同是否提示其功能有差异,还有待于深入研究。这是关于斑马鱼中Properdin基因表达及其表达模式的首次报道,我们已经纯化得到了Properdin重组蛋白,为以后利用免疫结合等生物学技术探索Properdin蛋白的结构、功能及作用机制奠定了基础。深入了解其功能,有助于我们阐明人类补体缺乏病理机制,也促进我们对鱼类补体系统的功能有更深入的理解。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-9
第一章文献综述  9-26
  1. 发育生物学研究的新模式动物—斑马鱼  9-10
    1.1 斑马鱼的基本生物学特征  9
    1.2 斑马鱼----脊椎动物中的果蝇  9-10
  2. 免疫系统的组成  10-20
    2.1 免疫的类型和特点  10-11
    2.2 脊椎动物补体系统概况  11-20
    2.3 无脊椎动物免疫系统研究进展  20
  3. 补体Properdin(P 因子)的研究概况  20-24
    3.1 Properdin 蛋白的理化性质  21
    3.2 Properdin 蛋白的结构域特征  21-22
    3.3 Properdin 蛋白的研究进展  22-24
  4. 研究目的与技术路线  24-26
    4.1 研究目的  24-25
    4.2 技术路线  25-26
第二章斑马鱼 Properdin 基因的克隆、鉴定、表达和功能  26-61
  1. 前言  26-27
  2. 材料与方法  27-47
    2.1 斑马鱼 Properdin 基因序列的克隆  27-34
    2.2 序列比对及系统进化分析  34-35
    2.3 重组蛋白pET28a/Properdin 的原核表达  35-47
  3. 实验结果  47-59
    3.1 斑马鱼 Properdin 基因 ORF 的克隆  47-48
    3.2 Properdin 基因的序列分析  48-51
    3.3 Properdin 基因的系统进化分析  51-55
    3.4 重组蛋白 Properdin 的表达与纯化  55-59
  4. 讨论  59-61
第三章斑马鱼 Properdin 基因个体发育与不同组织中的表达模式  61-70
  1. 前言  61-62
  2. 材料和方法  62-65
    2.1 斑马鱼不同发育时期、不同组织 RNA 的反转录  62
    2.2 Real-time PCR 分析  62-65
  3. 实验结果  65-69
    3.1 反转录cDNA 的质量检测结果  65-66
    3.2 引物有效性  66
    3.3 斑马鱼 Properdin 基因实时荧光定量 PCR 检测  66-69
  4. 讨论  69-70
参考文献  70-79
致谢  79-81
作者简介  81

斑马鱼Properdin基因的鉴定、表达和功能特性

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