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川西北猕猴MHC-DRB基因外显子2多态性研究

作　者: 杜丹丹
导　师: 徐怀亮
学　校: 四川农业大学
专　业: 动物学
关键词: 猕猴主要组织性复合体 Mamu-DRB 多态性 DGGE
分类号: Q75
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

本试验以四川西北部地区的3个猕猴群体为研究对象,采用PCR扩增技术、变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)和基因克隆等分子生物学方法对82个野生猕猴MHC-DRB(MHCⅡ类基因DR亚区,B链)基因二号外显子(exon 2)的多态性进行了测定与分析。试验中测得的3个猕猴群体的DRB基因二号外显子序列通过NCBI进行序列同源性比对,对新等位基因进行了命名。在NCBI上下载其他灵长类DRB基因二号外显子序列,同时结合本试验中获得的序列,采用N-J法构建DRB基因聚类树,分析其种群进化关系；同时分析了等位基因频率分布,核苷酸组成,氨基酸序列变异,核苷酸多样度以及群体间遗传距离。获得如下结果：(1)共检测到71个猕猴MHC-DRB等位基因(Mamu-DRB),其中有59个为本研究中首次发现的新等位基因。将82个猕猴个体作为一个大群体来看,等位基因频率最高的为：Mamu-DRB4*0104(0.048);从群体间来看,存在个别群体共享等位基因(Mamu-DRB4*0104, Mamu-DRB*W2704, Mamu-DRB6*011201, Mamu-DRB6*0123),另外,3个群体又都具有多个种群特有等位基因,如：Mamu-DRB*W270302, Mamu-DRB*W270303, Mamu-DRB6*0114等,为丹巴群体所特有的等位基因；Mamu-DRB*W250903, Mamu-DRB1*1011, Mamu-DRB1*0328等,只出现在北川群体中；Mamu-DRB1*1012, Mamu-DRB*W108, Mamu-DRB1*041201等,则只在黑水群体中被发现。(2)通过对新发现的59个Mamu-DRB等位基因氨基酸序列的比较,80个氨基酸残疾中有62个发生突变,其中有9个残基(29,32,35,39,43,45,52,62,70)为单个氨基酸残基的突变,其余18个位点没有发现突变。80个氨基酸残基中包含有13个抗原结合位点(Antigen binding sites, ABS),对其进行分析后发现其中有9个ABS位点发生变异,占69.23%；而在剩余的其它67个非抗原结合位点(Non-ABS)位点中43个发生变异,占64.170%,说明发生在抗原结合区域的氨基酸替换事件高于非抗原结合区域。(3)从基于不同物种来源的DRB等位基因的构建系统发生树(N-J)中发现,来自于食蟹猴的15个Mafa-DRB基因并没有完全统一地聚集在一起,而是穿插于已公布以及新发现的Mamu-DRB之间,这表明等位基因间存在着跨种多态(Trans-species polymorphism,TSP)现象,表明新的等位基因的出现可能是相同或近似自然选择压力下趋同进化(convergent evolution)的结果；另外,系统树中选择的9个人的HLA-DRB基因其中有2个分散地分布于新发现的Mamu-DRB等位基因之间,这表明新发现的等位基因与相应的HLA-DRB共享许多位点及世系。(4)基于Fu and Li’s检验法计算群体内部核苷酸多样度(Pi)值,其中丹巴、北川、黑水三个群体的Pi值依次为：0.13077,0.15278,0.13513。由此可以判断,三个群体中北川群体的遗传多样性最高,丹巴群体则相对其他两个群体较低。同时通过RDP软件分析得出,在北川群体中有基因重组事件的发生,这是造成其遗传多样性丰富的因素之一(5)群体间遗传距离分析得出北川与黑水两个群体之间的遗传距离最高(0.158),其次为北川与丹巴之间(0.156),丹巴与黑水之间的遗传距离最低(0.145)。结合三个种群所处的地理环境分析,3个猕猴群体间的遗传距离大小基本反映了各群体间的地理分布关系。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-12
1 文献综述  12-32
  1.1 猕猴概述  12-13
    1.1.1 猕猴分布及分类  12
    1.1.2 猕猴在生物医学研究中的应用  12-13
  1.2 主要组织相容性复合体(MHC)  13-21
    1.2.1 MHC的起源和进化  14
    1.2.2 MHC基因定位及其命名  14-15
    1.2.3 MHC多态性及其维持机制  15-18
    1.2.4 MHC功能及应用  18-21
  1.3 猕猴MHC(Mamu)Ⅱ类基因的结构功能和多态性研究进展  21-25
    1.3.1 MamuⅡ类基因的结构和定位  21-22
    1.3.2 MamuⅡ类基因多态性研究进展  22-25
  1.4 MamuⅡ类基因的多态性研究方法  25-30
    1.4.1 DGGE技术及其工作原理  27-29
    1.4.2 DGGE在MHC研究中的运用  29-30
  1.5 论文研究内容及意义  30-32
2 材料与方法  32-43
  2.1 实验材料  32-36
    2.1.1 实验动物及样本处理  32
    2.1.2 主要仪器设备  32-33
    2.1.3 主要试验试剂及其配制  33-36
  2.2 基因组DNA的提取与检测  36-37
    2.2.1 基因组DNA的提取  36
    2.2.2 DNA溶液浓度的检测  36-37
  2.3 Mamu-DRB外显子2序列的扩增  37-38
    2.3.1 引物的选择与设计  37
    2.3.2 Mamu-DRB二号外显子的一次PCR扩增  37-38
    2.3.3 PCR产物电泳检测  38
  2.4 PCR产物的DGGE检测及条带回收  38-42
    2.4.1 PCR产物的DGGE检测  38-39
    2.4.2 回收条带的二次PCR扩增  39
    2.4.3 克隆测序  39-42
  2.5 序列分析方法  42-43
3 结果与分析  43-55
  3.1 基因组DNA提取结果  43
  3.2 PCR产物检测结果  43-46
    3.2.1 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测  43-44
    3.2.2 Mamu-DRB一次PCR扩增产物的DGGE分离  44-45
    3.2.3 二次PCR产物的克隆结果  45-46
  3.3 DRB基因exon 2序列变异性分析  46-55
    3.3.1 Mamu-DRB等位基因在川西北猕猴群体中的频率分布  47-51
    3.3.2 猕猴DRB等位基因exon2的自然选择性检验  51-52
    3.3.3 猕猴DRB等位基因的氨基酸序列比对  52-53
    3.3.4 Mamu-DRB等位基因的系统发生分析  53-55
    3.3.5 群体遗传多样性及遗传距离分析  55
4 讨论  55-62
  4.1 样本选取  55-56
  4.2 PCR条件和引物设计  56-57
  4.3 DGGE  57-58
    4.3.1 电泳条件的优化  57
    4.3.2 变性梯度的确定  57
    4.3.3 染色效果的影响因素  57-58
  4.4 MHC-DRB基因的多态性分析  58-62
    4.4.1 MHC-DRB基因与种群生存力的关系  58-59
    4.4.2 Mamu-DRB基因的种群特异性分析  59-61
    4.4.3 自然选择作用  61
    4.4.4 MHC-DRB基因的系统进化分析  61-62
5 结论  62-63
参考文献  63-67
致谢  67

川西北猕猴MHC-DRB基因外显子2多态性研究

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