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拟南芥原生质体分离及水稻植酸酶基因OsMINPP瞬时表达研究

作　者: 赵严伟
导　师: 李合松
学　校: 湖南农业大学
专　业: 生物物理学
关键词: 拟南芥 原生质体 瞬时表达 OsMINPP
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


探讨模式植物拟南芥的原生质体分离方法及基因瞬时表达对生物学研究具有重要意义。本研究以哥伦比亚野生型拟南芥为试验材料,对其叶及根组织进行原生质体分离,优化了拟南芥叶原生质体瞬时表达体系,初步建立了拟南芥根原生质体瞬时表达体系。并以此为基础,探讨了OsMINPP的亚细胞定位及植物激素对OsMINPP表达的影响。主要试验结果如下：1.纸胶带去拟南芥叶下表皮可降低原生质体破碎率。通过采用不同的叶片处理方法,发现纸胶带去下表皮处理可将原生质体破碎率降低至1.8%,与常规的切条处理相比,其破碎率减少了92.1%。2.CaCl2处理可提高拟南芥叶原生质体产量。通过在WI、W5、MMG中添加0-50mmol/L CaCl2,发现CaCl2可提高原生质体产量且在WI中补充10mmol/L CaCl2时原生质体产量最高。3.IAA与GA3处理可促进拟南芥叶原生质体分离。通过材料喷施及酶液注入两种植物激素处理方式,发现IAA与GA3均能促进原生质体分离。与对照相比,原生质体产量分别提高了46.9%及48.3%。4.获得了拟南芥根原生质体分离的较佳体系。通过优化拟南芥根原生质体分离中的各种因素,发现用1/2 MS固体培养基培养材料、1.5%纤维素酶R10与0.4%离析酶R10水解细胞壁、0.4 M甘露醇维持渗透压、1600rpm(200g)离心纯化时,根原生质体产量较高(9.23×106个/克)。5.获得了拟南芥根原生质体成功瞬时表达的体系。通过优化瞬时表达体系中的各种因素,发现30%PEG、25μg质粒与7.5×104个拟南芥根原生质体共同孵育5min后,瞬时表达效率较高(62.24%)。6.GA3处理可提高OsMINPP启动子活性。通过在OsMINPP启动子瞬时表达体系中分别加入10-6mol/L浓度的IAA、BL、ABA、GA3与其共同孵育12 h后荧光检测其GUS活性,发现GA3组的GUS活性约是对照的2.14倍,促进了OsMINPP启动子的表达。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-9
1 引言  9-15
  1.1 原生质体及其分离  9-11
    1.1.1 原生质体  9-10
    1.1.2 原生质体分离  10-11
  1.2 外源基因在原生质体中的瞬时表达  11-13
  1.3 植酸酶  13-14
    1.3.1 植酸与植酸酶  13-14
    1.3.2 MINPP  14
  1.4 研究目的与意义  14-15
2 材料与方法  15-24
  2.1 试验材料  15-16
    2.1.1 植物材料  15
    2.1.2 菌种与质粒  15
    2.1.3 主要药品  15
    2.1.4 主要溶液及配方  15-16
    2.1.5 主要仪器设备  16
  2.2 试验方法  16-24
    2.2.1 材料培养  16-17
    2.2.2 原生质体分离  17-18
    2.2.3 OsMINPP克隆  18-20
    2.2.4 OsMINPP启动子克隆  20-22
    2.2.5 OsMINPP载体构建  22
    2.2.6 OsMINPP启动子载体构建  22-23
    2.2.7 质粒提取  23
    2.2.8 PEG-Ca转化  23-24
3 结果与分析  24-40
  3.1 原生质体分离条件探索  24-32
    3.1.1 叶肉细胞原生质体分离条件优化  24-30
    3.1.2 根细胞原生质体分离优化  30-32
  3.2 OsMINPP及其启动子克隆及载体构建  32-34
    3.2.1 OsMINPP cDNA的获得  32-33
    3.2.2 OsMINPP植物双元表达载体检测  33
    3.2.3 OsMINPP启动子基因序列获得  33-34
    3.2.4 OsMINPP启动子植物双元表达载体检测  34
  3.3 OsMINPP瞬时表达  34-40
    3.3.1 外源基因在叶原生质体中瞬时表达体系的优化  34-37
    3.3.2 外源基因在根原生质体瞬时表达的体系建立  37-40
4 结论与讨论  40-43
  4.1 纸胶带去拟南芥叶下表皮可降低原生质体破碎率  40
  4.2 CaCl_2处理可提高拟南芥叶原生质体产量  40-41
  4.3 IAA与GA_3处理可促进拟南芥叶原生质体分离  41
  4.4 获得了拟南芥根原生质体分离的较佳体系  41-42
  4.5 获得了外源基因在拟南芥根原生质体中成功瞬时表达的体系  42
  4.6 GA_3处理可提高OsMINPP启动子活性  42-43
  4.7 OsMINPP在根及叶细胞中分别定位于内质网及细胞膜上  43
5 创新性  43-44
参考文献  44-51
缩略词  51-52
致谢  52-53
作者简历  53

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学 > 植物基因工程
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