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转小鼠古洛糖酸内酯氧化酶基因拟南芥的评估

作　者: 李坤岚
导　师: 唐克轩
学　校: 复旦大学
专　业: 遗传学
关键词: 维生素C L-古洛糖酸-1，4-内酯氧化酶(GLO) 拟南芥干旱胁迫盐胁迫
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

植物中维生素C(L-ascorbic acid, AsA)是植物抗氧化系统中非酶抗氧化物质的重要成员。它协同相关作用酶清除植物在正常生理状态、各种环境胁迫中产生的活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS),以减轻氧化损伤对植物造成的伤害。VC作为人类等动物的不可或缺的营养物质必须在日常饮食中摄入。通过转基因手段提高植物中的VC含量,不仅能提高植物的营养品质,还能提高植物对各种非生物胁迫的耐受性。目前对植物VC合成的半乳糖途径和糖醛酸途径已有较多报道,但越来越多的研究表明植物中VC合成与动物VC合成古洛糖途径存在联系。探索动物VC合成途径中关键酶在植物VC合成过程中的作用成为了目前的一个研究热点。L-古洛糖酸-1,4-内酯氧化酶(L-Gulono-1,4-lactone oxidase, GLOase, EC 1.1.3.8)是植物中天然AsA合成途径中最后一步关键酶。本研究首次以小鼠(Mus musculus)L-古洛糖酸-1,4-内酯氧化酶(L-Gulono-1,4-lactone oxidase, GLOase)基因转化模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana),并分别测试了转基因拟南芥在干旱和盐胁迫下的耐受性。转基因植株中AsA含量最高株系为5.74μmol/g FW,是野生型(WT)拟南芥的3.46倍、转空质粒对照(CK)拟南芥的3.19倍。用30%PEG-6000模拟干旱胁迫,不同时间梯度下转基因拟南芥丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量低于同样处理下WT、CK拟南芥,暗示转基因拟南芥抗干旱胁迫能力得到了提高。NaCl模拟盐胁迫实验中,分别用50mmol/L, 100mmol/L,150mmol/L,200mmol/L NaCl处理子叶期、幼苗期拟南芥。各个盐浓度处理条件下,子叶期的转基因拟南芥相比于WT、CK平均根长更长、侧根发育更充分；幼苗期的转基因拟南芥莲座叶显著优于WT、CK,且叶片MDA的含量更低,暗示了转基因拟南芥的耐盐性有所提升。本研究针对动物AsA合成途径关键酶转化植物对植物VC含量提高进行了探讨,并且从植物抗旱性、耐盐性方面分析了转VC相关基因植物耐受非生物胁迫的能力,为获得高营养品质、高耐受性的转基因植物奠定了基础。

全文目录

缩写词表  5-6
摘要  6-7
Abstract  7-8
第一章文献综述  8-25
  1.1 维生素C作用及研究意义  8-13
    1.1.1 动物体内生理功能  8-9
    1.1.2 维生素C的经济价值  9-12
    1.1.3 提高植物维生素c的意义  12-13
  1.2 维生素C合成途径  13-19
    1.2.1 古洛糖途径  14-17
      1.2.1.1 GLOase基因  16-17
    1.2.2 半乳糖途径  17-18
    1.2.3 肌醇途径  18
    1.2.4 糖醛酸途径  18-19
  1.3 植物中维生素C功能  19-25
    1.3.1 维生素C与环境胁迫  19-23
    1.3.2 维生素C与细胞分裂  23-24
    1.3.3 维生素C与细胞壁代谢  24-25
第二章材料与方法  25-42
  2.1 材料  25-27
    2.1.1 动植物材料  25
    2.1.2 菌株和质粒  25
    2.1.3 酶与试剂盒  25-26
    2.1.4 细菌和植物培养基  26
    2.1.5 抗生素配制  26-27
    2.1.6 引物合成与测序  27
  2.2 实验方法  27-42
    2.2.1 小鼠gulo基因的克隆  27-31
    2.2.2 含目标质粒的农杆菌制备  31-32
    2.2.3 拟南芥的种植、转化与纯系筛选  32-34
    2.2.5 转基因植物的分子生物学检测  34-38
    2.2.6 基因表达量分析  38-40
    2.2.7 HPLC法测定维生素C含量  40
    2.2.8 逆境处理及抗逆性能测定  40-42
第三章实验结果  42-53
  3.1 gulo基因克隆  42-43
    3.1.1 小鼠肝脏总RNA抽提  42
    3.1.2 目标基因RT-PCR并电泳  42-43
  3.2 表达载体的构建  43-44
  3.3 转gulo基因、CK拟南芥的获得  44-47
    3.3.1 DNA水平及纯系筛选  44-46
    3.3.2 Western blot  46-47
  3.4 维生素C含量及gulo基因表达情况  47-49
  3.5 耐盐性分析  49-52
    3.5.1 子叶期盐胁迫  49-51
    3.5.2 幼苗期盐胁迫  51-52
  3.6 抗旱性分析  52-53
第四章总结与展望  53-55
  1.研究总结  53-54
  2.后续研究方向  54-55
论文发表情况  55-56
致谢  56-57
参考文献  57-64

转小鼠古洛糖酸内酯氧化酶基因拟南芥的评估

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