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抗Asia1型FMDV单克隆抗体的研制及抗原捕获ELISA方法的初步建立

作　者: 李万
导　师: 杨增岐；于力
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 预防兽医学
关键词: Asia1型口蹄疫病毒单克隆抗体抗原捕获ELISA
分类号: S854.43
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

用纯化的Asia1型口蹄疫病毒免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA和间接免疫荧光(IFA)免疫检测方法筛选,有限稀释法克隆,获得了6株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1B4、1F5、3D9、3E11、3H6和5G3。间接ELISA测定,6株杂交瘤细胞培养上清效价分别为1:1024、1:256、1:256、1:256、1:64和1:128,小鼠腹水效价分别为5×10-4、1×10-4、1×10-4、1×10-4、1×10-4和8×10-3; ELISA和IFA结果显示,单抗1B4、1F5、3E11、3H6和5G3仅与Asia1型FMDV毒株反应,不与O型FMDV毒株反应,为抗Asia1型FMDV的型特异性单克隆抗体;3D9既与Asia1型FMDV毒株反应,又与O型FMDV毒株反应,表明它为针对两种血清型FMDV的共享表位单抗。Western blot分析表明,这6株单克隆抗体均不与全病毒抗原反应,表明它们所针对的抗原表位均为构象表位。相加ELISA试验表明,6株单抗分别识别不同的抗原表位。运用胰酶处理的Asia1型FMDV抗原进行间接ELISA,结果显示各株单抗识别的抗原表位均为胰酶敏感性表位。经硫氰酸盐洗脱法测定,1B4、1F5、3D9、3E11、3H6和5G3的相对亲和力指数分别为1.5mol/L、2.5mol/L、3.5mol/L、2.5mol/L、1.0mol/L、和1.5mol/L。用亲和层析纯化的牛抗Asia1型FMDV阳性血清和1B4型特异性单抗,分别作为包被抗体和检测抗体,初步建立了快速检测Asia1型FMDV的抗原捕获ELISA方法,并对试验条件进行了优化。确定的包被抗体的最佳包被浓度为7.375μg/mL,检测抗体的最佳使用浓度为0.625μg/mL。敏感性试验表明,该方法对Asia1型FMDV提纯抗原的最小检出量为109ng/100μL,对细胞毒的最低检出量为103TCID50。特异性试验表明,本方法检测O型FMDV、牛结核病、牛肺疫、牛流行热、赤羽病、牛粘膜病等病原均不发生交叉反应,具有良好的特异性。本研究成功制备了6株针对Asia1型FMDV的单抗,在对这些单抗进行免疫学鉴定和生物学定性的基础上,初步建立了FMDV抗原捕获ELISA方法。这些研究结果,为用ELISA方法诊断FMD以及FMDV抗原表位结构与功能的研究建立了基础。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-9
文献综述  9-20
  第一章口蹄疫研究概况  9-20
    1.1 口蹄疫的流行及其危害  9-10
    1.2 口蹄疫病毒的特性  10-11
      1.2.1 口蹄疫病毒分类学地位、病毒粒子的形态、结构及理化特性  10
      1.2.2 口蹄疫病毒基因组结构及其功能  10-11
    1.3 口蹄疫的病原学诊断研究进展  11-16
      1.3.1 病毒分离鉴定  12
      1.3.2 病原鉴定  12-16
    1.4 单克隆抗体在FMD 研究中的应用  16-20
      1.4.1 FMD 病毒抗原位点的分析和定位  17
      1.4.2 FMD 病毒受体结合位点的研究  17
      1.4.3 FMD 病毒抗原结构和生物学功能相关性研究  17-18
      1.4.4 鉴定跟踪病毒株抗原变异  18
      1.4.5 单抗在FMDV 诊断检疫中的应用及存在的问题  18-19
      1.4.6 单克隆抗体在Asia1 型FMDV 研究中的应用  19-20
试验研究  20-45
  第二章抗ASIA1 型FMDV 单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定  20-37
    2.1 材料  20-21
      2.1.1 病毒  20
      2.1.2 试验动物与细胞系  20
      2.1.3 主要试剂及耗材  20
      2.1.4 主要仪器与设备  20-21
    2.2 方法与步骤  21-27
      2.2.1 试剂的配制  21
      2.2.2 抗原制备  21-22
      2.2.4 间接免疫荧光检测方法的建立  22
      2.2.5 动物免疫  22
      2.2.6 杂交瘤细胞株的建立  22-24
      2.2.7 单克隆抗体腹水的制备及纯化  24-25
      2.2.8 单克隆抗体的鉴定  25-27
    2.3 结果  27-34
      2.3.1 抗原的制备及鉴定  27-28
      2.3.2 间接ELISA 检测方法的建立  28
      2.3.3 杂交瘤细胞株的建立  28
      2.3.4 腹水单抗的纯化  28-29
      2.3.5 单克隆抗体效价的测定  29
      2.3.6 mAb 特异性鉴定  29-31
      2.3.6 单克隆抗体免疫球蛋白亚类的鉴定  31
      2.3.7 单克隆抗体的中和活性  31-32
      2.3.8 单克隆抗体相对亲和力指数测定  32
      2.3.9 单克隆抗体识别的抗原表位  32-34
      2.3.10 杂交瘤细胞的染色体分析  34
    2.4 讨论  34-37
  第三章 ASIA1 型 FMDV 抗原捕获ELISA 方法的初步建立  37-45
    3.1 材料  37
      3.1.1 病毒与血清材料  37
      3.1.2 试剂  37
      3.1.3 主要仪器与设备  37
    3.2 方法与步骤  37-39
      3.2.1 试剂配制  37
      3.2.2 牛抗Asia1 型FMDV 阳性血清和单克隆抗体的纯化  37-38
      3.2.3 抗Asia1FMDV 多抗包被浓度及单抗使用浓度的确定  38
      3.2.4 酶标抗体使用浓度及反应时间的确定  38
      3.2.5 封闭液的选择  38
      3.2.6 待检抗原反应时间的确定  38-39
      3.2.7 底物反应时间的确定  39
      3.2.8 敏感性试验  39
      3.2.9 特异性阻断试验  39
      3.2.10 特异性试验  39
    3.3 结果  39-43
      3.3.1 牛抗Asia1 型FMDV 阳性血清和单克隆抗体184 的纯化  39-40
      3.3.2 抗Asia1 FMDV 多抗最佳包被浓度及单抗最佳使用浓度的确定  40
      3.3.3 酶标抗体使用浓度及反应时间的确定  40-41
      3.3.4 封闭液的选择  41
      3.3.5 检测抗原最佳反应时间的确定  41-42
      3.3.6 底物最佳反应时间的确定  42
      3.3.7 敏感性试验  42-43
      3.3.8 特异性阻断试验  43
      3.3.9 特异性试验  43
    3.4 讨论  43-45
结论  45-46
参考文献  46-50
缩略词  50-51
致谢  51-52
作者简介  52

抗Asia1型FMDV单克隆抗体的研制及抗原捕获ELISA方法的初步建立

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