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基于RCA放大效应及纳米粒子的高灵敏蛋白质检测方法研究

作　者: 周龙
导　师: 楚霞
学　校: 湖南师范大学
专　业: 分析化学
关键词: 核酸识体血小板源生长因子BB 滚环DNA扩增银沉积脂质体前列腺特异性抗原(PSA) 生物沉积纳米金电化学免疫分析催化氢还原
分类号: O629.73
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 210次
引　用: 2次
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内容摘要

蛋白质是一类重要的生物标志物，许多肿瘤生物标志物就属于酶类、抗原类物质及微球蛋白、铁蛋白等蛋白类物质。蛋白质免疫分析在生命科学研究中具有重要意义，广泛应用于生物学、医学诊断等方面。目前常用的蛋白质检测方法有RIA（Radioimmunoassay，放射免疫实验）、ELISA（Enzyme-linked immunosorbentassay，酶联免疫吸附实验）、蛋白免疫印迹等方法，这些方法在蛋白质检测和定量中发挥着重要的作用。随着生命科学的发展，已有方法的局限性已日益显露出来，在一些特殊需要领域如疾病早期诊断等高灵敏度的检测领域大大受限。所以研究普遍适用性好、操作简便、灵敏度高的蛋白质免疫检测新方法显得越来越迫切。目前，核苷酸通过RCA扩增放大技术使其检测限低至几个分子水平，大大高于蛋白质的检测限，因此本研究利用核酸和蛋白质的关系通过检测核酸的量实现蛋白质的超灵敏度检测。本研究分三部分：第一部分：基于核酸识体（aptamer）的滚环DNA扩增反应用于PDGF-BB的检测。提出了一种新颖的、高灵敏的基于抗体-抗原-核酸识体夹心法和DNA滚环扩增（RCA）的方法用于血小板源生长因子BB（PDGF-BB）的检测。在aptamer的3’端连接RCA反应的引物，在φ29 DNA聚合酶、脱氧核糖核苷酸及环形模板存在下，经过滚环扩增反应后，可得到一条与环形DNA模板互补的重复序列的DNA单链，利用生物素标记的互补寡核苷酸探针与扩增产物杂交，再用亲和素标记的碱性磷酸酶与之反应，将反应后的产物在底物溶液中进行银沉积反应，最后用电化学方法检测电极表面沉积的银的量，通过检测银的量来达到检测PDGF-BB的目的。考察了抗体固定化浓度、RCA反应时间和其它蛋白对测定信号的影响。结果表明，RCA扩增反应能显著提高检测的灵敏度，降低检测下限。PDGF-BB在0.5pg／mL～8000pg／mL的范围内呈现良好的线性关系，检测下限为0.2pg／mL。该方法在蛋白质的检测和医学诊断等方面有很大的应用前景。第二部分：脂质体滚环DNA扩增反应用于PSA的超灵敏检测。研究了一种新型的基于脂质体信号放大的超灵敏免疫分析方法用于检测前列腺特异性抗原（PSA）。将DNA寡核苷酸包埋在脂质体中，它的序列与后续滚环DNA扩增反应（RCA）反应所需引物的序列一样。再在脂质体的表面包被好PSA的抗体。在微孔板上固定好PSA的抗体，与PSA抗原反应后再将包被了抗体的脂质体与之反应，再用表面活性剂将结合上的脂质体溶解，超声破碎，包埋在脂质体中的DNA寡核苷酸被释放出来。这些DNA寡核苷酸就充当了RCA反应的引物，在φ29 DNA聚合酶、脱氧核糖核苷酸及环形模板存在下，经过滚环扩增反应后，可得到一条与环形DNA模板互补的重复序列的DNA单链，利用荧光素标记的互补寡核苷酸探针和生物素标记的互补寡核苷酸探针与扩增产物杂交，再用亲和素标记的微珠捕获反应产物，最后通过检测荧光信号的强度来达到检测PSA的目的。该方法通过两步放大，即在脂质体中包埋大量的DNA寡核苷酸和进行滚环DNA扩增反应，使得检测PSA的灵敏度大大提高，检测下限大大降低，达到1×10^-18g／ml。由于DNA寡核苷酸的序列是多种多样的，这使得这种检测方法有很大的应用前景，可用来检测多种蛋白质，在疾病研究、医学诊断上有极为重要的意义。第三部分：基于纳米金介导生物沉积铂并以铂催化氢还原伏安法进行检测的高灵敏电化学免疫分析新方法。该方法采用夹心免疫分析模式，实现了人免疫球蛋白（HIgG）的测定。首先在聚苯乙烯微孔板中固定羊抗HIgG捕获抗体，HIgG捕获后，碱性磷酸酶标记的HIgG抗体修饰的纳米金探针通过与HIgG形成夹心复合物而结合在微孔板上。结合的碱性磷酸酶催化抗坏血酸磷酸酯底物水解产生抗坏血酸，后者在纳米金上介导下还原铂离子沉积于纳米金表面。沉积的金属铂用王水溶解并电富集于玻碳电极上。通过测定铂催化氢还原产生的阴极电流，可实现HIgG的高灵敏分析。催化氢还原电流与HIgG浓度对数在0.1～100ng／ml之间呈线性相关性，检测下限达22pg／ml。由于铂催化氢还原的高灵敏度及纳米金介导的生物沉积放大反应，该法具有较高的分析灵敏度，且免疫分析微孔板模式使得该法可同时用于大量样品的分析。

全文目录

中文摘要  3-6
英文摘要  6-12
第一章绪论  12-29
  1.1 引言  12-13
  1.2 蛋白质免疫分析方法  13-22
  1.3 RCA技术及其在蛋白质检测中的应用  22-26
  1.4 本研究工作的构思  26-29
第二章 Aptamer-RCA:一种通用的高灵敏的蛋白质电化学检测平台  29-48
  2.1 引言  29-32
  2.2 实验部分  32-35
  2.3 结果与讨论  35-47
  2.4 结论  47-48
第三章脂质体滚环DNA扩增反应用于PSA的超灵敏检测  48-66
  3.1 引言  48-51
  3.2 实验部分  51-55
  3.3 结果与讨论  55-65
  3.4 结论  65-66
第四章一种基于纳米金介导生物沉积铂催化氢还原的电化学免疫分析新方法  66-79
  4.1 引言  66-67
  4.2 实验部分  67-69
  4.3 结果与讨论  69-77
  4.4 结论  77-79
结语  79-80
参考文献  80-93
致谢  93-94
附录1 (硕士期间发表的论文)  94-95

基于RCA放大效应及纳米粒子的高灵敏蛋白质检测方法研究

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