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基于纳米金信号转换和信号放大的新型生物传感技术研究

作　者: 刘雪平
导　师: 俞汝勤；沈国励
学　校: 湖南大学
专　业: 分析化学
关键词: 纳米金信号转换和信号放大生物传感技术表面等离子体共振吸收光谱荧光光谱核酸适体电化学免疫分析 T-Hg(Ⅱ)-T配位腺苷人免疫球蛋白IgE
分类号: Q503
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

纳米金具有独特的光学效应,其表面等离子体共振吸收峰的位置与颗粒的大小、形貌及聚集状态密切相关,摩尔吸光系数高。此外,纳米金具有优良的晶核催化功能,能够催化金属离子还原并沉积于纳米金表面。通过生物识别过程使纳米金的聚集状态发生一定程度的改变,然后监测其表面等离子体共振吸收的变化,或者利用纳米金催化性能使金属离子还原为金属原子,根据金属离子(或金属原子)数量的改变从而使体系的物理化学参数发生相应变化,最终实现生物识别过程的信号转换。纳米金比表面积大,表面自由能高,可在颗粒表面固定大量的生物识别分子或信号分子。此外,纳米金具有良好的导电性和宏观隧道效应,能够促进电子快速传递,从而实现信号放大。纳米金作为生物标记物或者固定生物分子的优良载体在临床诊断、食品安全和环境监测等领域中应用非常广泛。本论文以腺苷、人IgE、甲胎蛋白、赭曲霉素A、汞离子为检测对象,发展了一系列基于纳米金信号转换(第二、三、四章)以及信号放大(第五、六、七章)的新型生物传感技术。具体内容包括:(1)基于不同构象的核酸适体在纳米金表面的吸附性质不同,从而对纳米金稳定性的保护程度有所区别。我们以腺苷为分析模型,发展了一种简单、快速、灵敏的基于非标记纳米金变色的比色或紫外可见吸收分光光度法【第2章】。当体系中不存在目标分子时,腺苷的核酸适体结构柔软,能够缠绕在金纳米颗粒表面,由于核酸链带负电荷,纳米金表面的电子云密度高,静电斥力增强,加入较高浓度的盐后胶体溶液仍然保持良好分散。当体系中存在腺苷时,它与核酸适体结合诱导适体构象发生变化,刚性增强,不易吸附于纳米金颗粒表面,因此在高盐条件下出现一定程度的团聚,表面等离子体共振吸收光谱发生改变,据此可用于定量检测腺苷,线性范围为100 nM -10μM,检测限为51.5 nM。该方法由于在均相中操作,准确度高,并且可实现高通量分析,也可用于其它物质如金属离子、蛋白质、核酸或多肽的分析。(2)纳米金是一种重要的光学材料,具有很高的消光系数,其颜色变化与颗粒间的距离密切相关。纳米金团聚通常分为夹心式的交联团聚和非交联团聚两种方式。在第3章中,我们提出一种新的纳米金团聚机理,即发夹型核酸适体末端匹配修饰纳米金后诱导纳米金组装,从而降低胶体稳定性,加入较高浓度的盐引起团聚。当溶液中存在目标分子IgE时,适体稳定的发夹构型显著抑制纳米金组装。鉴于此,我们开发了一种以IgE为分析模型的基于纳米金稳定性增强的均相比色分析方法。与目标IgE结合后,核酸适体构象发生变化,空间位阻增大,修饰到纳米金表面使颗粒稳定,呈分散状态,据此可用于IgE的分析测定,线性范围为9.45×10-13 - 1.89×10-8 M。与现有IgE检测方法相比较,该方法灵敏度高,所需仪器设备简便,可通过目视观察颜色变化或紫外可见分光光度计监测吸光度的变化。这种发夹型核酸适体衍生纳米金的组装行为在生物传感技术中的成功应用有助于加深理解核酸构象变换对纳米金性能的影响,同时也为设计新颖的信号探针以及开发优良性能的比色检测技术提供新思路。(3)开发了一种以腺苷为模型分析物的灵敏、特异的新型荧光分析方法【第4章】。该方法应用两种纳米材料标记的核酸探针?核酸适体修饰的磁性纳米颗粒和核酸探针混合修饰的金纳米颗粒。利用腺苷诱导核酸适体的构型转换导致与其杂交的金标核酸探针被置换,置换下来的纳米金标记物进而催化抗坏血酸将铜离子还原为金属铜并沉积在金纳米颗粒上,使铜离子对钙黄绿素的荧光淬灭得到抑制。由于极少量的纳米金可催化大量的铜离子还原沉积,铜离子浓度急剧降低,从而灵敏改变钙黄绿素的荧光信号。实验结果表明,用这种方法检测腺苷得到的动力学响应浓度范围为100 pM到10 nM,检测限为80 pM。此外,核酸适体的高度特异识别性能保证了该方法具有较好的选择性。整个实验过程都在均相中进行,适合大批量的分析检测。(4)构建了一种基于纳米金标记及酶催化增强的电化学免疫传感器对甲胎蛋白(AFP)进行灵敏检测【第5章】。金电极表面共价连接捕获抗体选择性地识别目标物AFP,纳米金标记的兔抗对目标物进行夹心反应,偶联碱性磷酸酯酶的羊抗兔IgG特异结合兔抗形成树枝状酶复合物,电极表面酶分子的增加增强了电化学响应信号,从而提高了传感器的灵敏度。该方法对目标物AFP的线性检测范围为1.0 ng/mL-500 ng/mL,检测下限为0.8 ng/mL,可用于实际血清样品中甲胎蛋白的临床分析检测。(5)开发了一种新型的基于间接竞争模式的电化学免疫传感器用于农产品中常见的有毒污染物—赭曲霉素A(OTA)的检测【第6章】。该传感器具备简便、灵敏、特异性好等优点。首先在金电极表面自组装1,6-己二硫醇单分子膜,然后通过Au-S作用组装一层金纳米颗粒构建传感界面,从而提高赭曲霉素A -卵清蛋白(OTA-OVA)偶联物在电极表面的负荷量,并增强电化学信号。当样品中存在游离的OTA时,它与固定于电极表面的OTA-OVA偶联物分子竞争结合溶液中有限的小鼠抗OTA单克隆抗体,碱性磷酸酯酶标记的马抗小鼠IgG二抗选择性地与电极表面的OTA单抗反应,据此,结合到电极表面上的酶分子数量能够反映样品中OTA的浓度。碱性磷酸酯酶催化底物1-萘酚磷酸酯(1-NP)水解生成1-萘酚,1-萘酚具有电活性,在电极表面氧化产生电信号。当OTA浓度在10 pg/mL-100 ng/mL范围内时,氧化峰电流的大小与OTA浓度成反比,检测下限达8.2 pg/mL。此外,在测定玉米样品中OTA的回收率过程中,样品的基体效应几乎可以忽略不计,得到回收率在85%-105.3%之间,说明该方法可望用于检测实际样品中OTA的含量。(6)发展了一种新型电化学生物传感器用于检测水相中的汞离子【第7章】。首先通过己二硫醇将纳米金组装于金电极表面,纳米金的存在可以增加作为捕获探针的核酸链的固定量,并改善电子传递速率。另一条富含T碱基的核酸链通过与捕获探针杂交连接到电极表面。当存在目标汞离子时, T-Hg(Ⅱ)-T配位作用使富T核酸链构象发生变化,致使电极表面的双链复合物不稳定,富T核酸链从电极表面解离下来。因此,电极表面剩余的核酸链吸附的电活性物质亚甲基蓝相应减少,响应信号降低,降低的程度与汞离子浓度密切相关。其定量检测汞离子的线性范围为1-500 nM,检测限为0.32 nM。该方法具有灵敏度高、选择性好,能用于实际样品中汞离子的检测。

全文目录

摘要  5-8
Abstract  8-15
第1章绪论  15-32
  1.1 纳米材料简介  15-16
  1.2 几种重要的纳米材料及其在生物传感分析中的应用  16-29
    1.2.1 纳米金  16-21
    1.2.2 磁性纳米颗粒  21-24
    1.2.3 碳纳米管  24-26
    1.2.4 量子点  26-29
  1.3 本研究论文的构想  29-32
第2章基于核酸适体构象变换诱导非标记纳米金凝集变色检测腺苷  32-40
  2.1 前言  32-33
  2.2 实验部分  33-34
    2.2.1 试剂与仪器  33
    2.2.2 纳米金的制备  33
    2.2.3 检测过程  33-34
  2.3 结果与讨论  34-38
    2.3.1 腺苷检测原理  34-36
    2.3.3 特异性考察  36-37
    2.3.4 对目标物腺苷的检测  37-38
  2.4 结论  38-40
第3章基于目标结合抑制核酸适体末端匹配诱导纳米金组装变色检测人IgE  40-53
  3.1 前言  40-41
  3.2 实验部分  41-42
    3.2.1 试剂与仪器  41-42
    3.2.2 制备稳定探针修饰的纳米金  42
    3.2.3 蛋白质检测过程  42
    3.2.4 研究核酸适体对纳米金组装的影响  42
  3.3 结果和讨论  42-52
    3.3.1 抗IgE 核酸适体修饰纳米金的团聚行为  42-43
    3.3.2 推测可能的团聚机理  43-46
    3.3.3 比色传感器的设计以及对IgE 的检测  46-47
    3.3.4 DNA 衍生纳米金的稳定性研究  47-49
    3.3.5 IgE 比色传感器的分析性能  49-50
    3.3.6 回收率测定  50-51
    3.3.7 选择性考察  51-52
  3.4 结论  52-53
第4章基于目标物诱导链置换及纳米金催化沉积铜的荧光分析法超灵敏检测腺苷  53-63
  4.1 前言  53-54
  4.2 实验部分  54-56
    4.2.1 试剂与仪器  54-55
    4.2.2 磁珠偶联SA 并与biotin-aptamer 结合（MNP-aptamer）  55
    4.2.3 金纳米颗粒的制备及其表面核酸探针的修饰  55
    4.2.4 荧光滴定法优化铜离子的用量  55-56
    4.2.5 纳米金对铜离子-钙黄绿素体系的荧光恢复  56
    4.2.6 腺苷的检测  56
  4.3 结果和讨论  56-62
    4.3.1 GNP-Probe 对钙黄绿素-铜离子体系的荧光恢复原理  56-59
    4.3.2 铜离子对钙黄绿素的荧光淬灭  59
    4.3.3 腺苷的检测原理  59-61
    4.3.4 腺苷的定量检测  61
    4.3.5 干扰实验  61-62
  4.4 小结  62-63
第5章基于纳米金树枝状酶复合物增强的电化学免疫传感器灵敏检测甲胎蛋白AFP  63-72
  5.1 前言  63-64
  5.2 实验部分  64-65
    5.2.1 试剂与仪器  64
    5.2.2 纳米金的制备  64
    5.2.3 纳米金标记抗体的制备  64-65
    5.2.4 传感界面的构建  65
    5.2.5 免疫反应过程  65
  5.3 结果与讨论  65-71
    5.3.1 实验原理  65-66
    5.3.2 传感器的电化学性质  66-67
    5.3.3 基于纳米金树枝状酶复合物的放大效应  67-68
    5.3.4 实验条件的优化  68-69
    5.3.5 本传感器的分析性能  69-71
  5.4 小结  71-72
第6章基于纳米金固定半抗原的超灵敏电化学免疫传感器检测赭曲霉素A  72-81
  6.1 前言  72-73
  6.2 实验部分  73-76
    6.2.1 试剂和仪器  73
    6.2.2 纳米金的制备  73
    6.2.3 偶联物的制备  73-74
    6.2.4 样品的制备  74
    6.2.5 传感界面的构建  74
    6.2.6 竞争免疫分析过程  74
    6.2.7 竞争免疫分析的原理  74-76
  6.3 结果与讨论  76-80
    6.3.1 免疫传感器的电化学特性  76-77
    6.3.2 OTA-OVA 偶联物和鼠抗OTA 用量的优化  77-78
    6.3.3 电化学免疫传感器的分析性能  78-80
    6.3.4 玉米样品中OTA 回收率的测定  80
  6.4 结论  80-81
第7章 T-Hg(Ⅱ)-T 结构诱导核酸链置换的非标记电化学汞离子生物传感器的研究.  81-90
  7.1 前言  81-82
  7.2 实验部分  82-83
    7.2.1 试剂与仪器  82
    7.2.2 传感器界面的构建  82-83
    7.2.3 电化学检测  83
  7.3 结果与讨论  83-88
    7.3.1 电化学生物传感器的分析原理  83-84
    7.3.2 传感器的电化学表征  84-85
    7.3.3 固定界面的影响  85-86
    7.3.4 传感器的性能  86-88
    7.3.5 自来水中H92+回收率的测定  88
  7.4 小结  88-90
结论  90-91
参考文献  91-118
附录攻读博士学位期间发表及完成的论文目录  118-119
致谢  119

基于纳米金信号转换和信号放大的新型生物传感技术研究

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