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基于酶催化放大的高灵敏电化学免疫传感技术研究

作　者: 文茜
导　师: 蒋健晖
学　校: 湖南大学
专　业: 分析化学
关键词: 生物沉积电化学免疫分析催化氢还原聚合酶放大
分类号: TP212.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

对于我们来说,探索开发一些简便、廉价、定量准确且易于操作推广的免疫分析方法是一件非常有意义的工作。因为就目前来说,尽管免疫分析技术被应用于临床医学、食品工业、环境监测等各个领域中,但其方法普遍存在着检测速度慢、灵敏度低、操作繁琐费时、仪器昂贵且需要专业技能,只能在少数实验室应用等缺点。因此,当务之急,应当建立一些准确、快速、灵敏度高、方便携带、成本低廉、易于时实监测的检测方法。生物免疫传感器以其所具有的特异的生物识别功能、极高的选择性,以及它可与现代的电化学分析方法相结合的优点,能产生一些简单、结果精确、灵敏、专一、微量和快速、成本低廉的检测方法,是当前各学科领域既新颖又极具吸引力的热门研究课题之一。电化学酶联免疫传感器是一种将抗原、抗体的免疫反应和酶的高效催化反应有机结合而发展起来的融合性技术。它的基本原理是通过化学或生物方法将酶与抗体或抗原结合起来,形成酶标记物或通过免疫学的方法将酶与抗酶体结合起来,形成免疫复合物,这些酶标记物或免疫复合物仍保持其免疫活性,然后它与相应的抗原或抗体反应,形成酶标记的或含酶的免疫复合物。结合在免疫复合物上的酶遇到相应的底物时,催化其发生水解、氧化或还原反应,或形成共价键结合点,通过电化学分析方法进行定性、定量测定。由于电化学酶联免疫传感器既具有免疫反应的特异性又具有电化学分析的灵敏性,因此其本身具有检测设备相对简单,使用方便,构制酶电极方法灵活,检测下限低,体系容易集成化,微型化等优点,实现了对目标物自动化、高灵敏的传感测定。本论文基于此做了一些相关的工作,具体内容包括:(1)建立了一种基于纳米金上生物沉积铂而催化氢还原的电化学免疫分析新方法(第二章)。近年来,由于各种金属标记物广泛应用于分析领域,使得以金属为标记物的金属免疫分析有了很大发展。以胶体金属颗粒为标记的电化学免疫分析因实验所需样品体积小、实验设备成本低且灵敏度高、分析速度快等优点成为金属免疫分析中最常用的一种方法。胶体金属颗粒作为标记物应用于金属免疫分析,一方面是直接利用金属纳米颗粒自身优异的光、电化学性质来进行免疫分析,另一方面,通过在纳米颗粒上沉积其它金属,使分析信号得到增强。铂作为一种优异的催化剂,已广泛应用于工业生产。而在化学分析领域中,主要是基于铂复合物等[43]为标记物及以纳米铂[44]为标记物来进行蛋白质检测和DNA分析。而我们利用在纳米金上生物沉积铂应用于电化学免疫分析则是首次报道。在本实验中,我们将纳米金标记的碱性磷酸酶标记抗体通过和目标分析物的夹心反应固定在聚苯乙烯微孔内,催化抗坏血酸磷酸酯水解产生抗坏血酸,使Pt(Ⅳ)还原并沉积在纳米金表面,沉积的铂在强酸中溶解释放并富集到玻碳电极上,能催化酸性溶液中的H+还原成H2,用线性扫描法可检测出该催化电流大小,该电流大小与在纳米金上沉积的铂的量成线性关系。因此根据铂催化氢还原的电流大小可间接实现对目标分析物H IgG的检测。(2)建立了一种基于生物沉积铜,并利用铂催化氢电化学还原的电化学免疫分析新方法(第三章)。在前一章的研究基础上,我们发展了另一种新型的电化学免疫分析方法。当铂沉积在玻碳电极上后,由于铂的催化作用,能减小H+在玻碳电极上的过电位,使H+在较正的电位下还原,产生一还原电流,通常称之为催化氢波。通过把铜沉积在镀有铂的玻碳电极上,由于铜附着在铂上后,降低了铂的催化催化氢还原的能力,使H+的还原电位向负方向产生位移。我们将碱性磷酸酶标记的抗体通过和目标分析物H IgG之间的夹心反应固定在聚苯乙烯微孔内后,利用碱性磷酸酶催化抗坏血酸磷酸酯水解后产生的抗坏血酸将Cu2+催化沉积在具有铂覆盖的玻碳电极表面,通过电化学检测,根据铂催化氢还原的电势大小可间接实现对目标分析物H IgG的检测。(3)建立了一种基于无需标记的聚合酶放大的电化学方法来检测人血清中的PDGF(第四章)。在人血小板中发现的血小板衍生生长因子(PDGF)作为一种有丝分裂原,能刺激成纤维细胞、神经胶质细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞的分裂增殖,以及诱导成纤维细胞、血管平滑肌细胞、单核细胞和中性粒细胞趋化[49-53]。PDGF的生物功能包括促进胚胎发育,伤口的愈合以及引起炎症。尽管在临床上PDGF没有用于疾病诊断,但有大量的研究工作表明在许多疾病的形成过程中,PDGF/PDGF受体形成的配合物起了很大的作用。例如癌症,过去二十多年的研究清楚地表明PDGF在肿瘤的发展过程中扮演了很重要的角色。PDGF除了与癌症有关以外,还与人类的许多疾病有联系。如动脉硬化症,肝硬化,血管球性肾炎等等。基于上述PDGF的重要性,在本论文中,我们设计了一种灵敏的且无需标记的电化学生物传感器,来实现对PDGF简便而快速的检测。首先将兔抗人PDGF-B抗体固定在电极上,然后通过该抗体将分析物PDGF-BB捕获到电极上。PDGF适配体在与模板DNA分子杂交后,在聚合酶作用下沿模板分子延伸并与模板DNA分子形成双链DNA结构,形成的双链DNA通过PDGF与其适配体形成的一种蛋白质-DNA复合物固定到电极表面,再将电活性物质亚甲基兰嵌入到双链DNA分子的沟槽结构中。通过方波脉冲伏安法可以检测到亚甲基兰的氧化峰电流,并可作为对PDGF-BB进行定量分析的依据。该方法具有灵敏度高,响应快,分析时间短以及分析成本低等优点。有助于将该方法应用于临床诊断分析。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-12
第一章绪论  12-19
  1.1 免疫传感器  12-13
    1.1.1 免疫传感器的结构  12
    1.1.2 免疫传感器的原理  12-13
  1.2 免疫传感器的分类  13-16
    1.2.1 电化学免疫传感器  13-14
      1.2.1.1 电流型免疫传感器  13-14
      1.2.1.2 电位型免疫传感器  14
      1.2.1.3 电容型免疫传感器  14
    1.2.2 酶免疫传感器  14-15
    1.2.3 压电免疫传感器  15-16
    1.2.4 光学免疫传感器  16
  1.3 免疫传感器的发展趋势和前景  16-17
    1.3.1 发展趋势  16-17
    1.3.2 电化学酶联免疫传感器的概念和基本原理  17
  1.4 本论文工作  17-19
第二章基于纳米金介导生物沉积铂催化氢还原的电化学免疫分析新方法  19-30
  2.1 实验部分  20-21
    2.1.1 试剂与仪器  20
      2.1.1.1 试剂  20
      2.1.1.2 仪器  20
      2.1.1.3 溶液的配制  20
    2.1.2 实验过程  20-21
      2.1.2.1 纳米金的制备  20-21
      2.1.2.2 纳米金标记 GAH IgG-ALP（GNP-GAH IgG-ALP）  21
      2.1.2.3 免疫分析过程  21
      2.1.2.4 测定方法  21
  2.2 结果与讨论  21-29
    2.2.1 分析过程的讨论与结果  21-23
    2.2.2 富集时间和电位对催化电流大小的影响  23-25
    2.2.3 纳米金上铂催化沉积反应条件的优化  25-26
    2.2.4 纳米金标记的碱性磷酸酶标记的羊杭人IgG 的培育时间  26-27
    2.2.5 性能分析  27-29
  2.3 结论  29-30
第三章基于生物沉积铜催化氢还原的电化学免疫分析新方法  30-39
  3.1 实验部分  30-31
    3.1.1 试剂与仪器  30-31
      3.1.1.1 试剂  30
      3.1.1.2 仪器  30-31
      3.1.1.3 溶液的配制  31
    3.1.2 实验过程  31
      3.1.2.1 玻碳电极的表面处理  31
      3.1.2.2 免疫分析过程  31
      3.1.2.3 测定方法  31
  3.2 结果与讨论  31-37
    3.2.1 分析过程的讨论与结果  31-34
    3.2.2 氯铂酸浓度对催化电压差值大小的影响  34
    3.2.3 铜离子浓度对催化电压差值大小的影响  34-35
    3.2.4 AA-P 浓度对催化电压差值大小的影响  35-36
    3.2.5 甘氨酸缓冲液pH 值对催化电压差值大小的影响  36
    3.2.6 铜催化沉积时间对催化电压差值大小的影响  36-37
    3.2.7 性能分析  37
  3.3 小结  37-39
第四章基于无需标记的聚合酶放大电化学方法检测血小板衍生生长因子  39-48
  4.1 实验部分  40-41
    4.1.1 试剂  40
    4.1.2 实验过程  40-41
      4.1.2.1 聚合酶反应  40
      4.1.2.2 免疫传感器的制备  40-41
      4.1.2.3 仪器与电化学检测  41
  4.2 结果与讨论  41-45
  4.3 PDGF-BB 定量分析  45
  4.4 实际样品的分析  45-46
  4.5 结论  46-48
小结  48-49
参考文献  49-55
致谢  55-56
附录A（攻读学位期间发表的学术论文目录）  56

基于酶催化放大的高灵敏电化学免疫传感技术研究

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