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D28k钙结合蛋白基因真核表达质粒的构建及其表达效果的研究

作　者: 李燕舞
导　师: 章世元
学　校: 扬州大学
专　业: 动物营养与饲料科学
关键词: 鸡D28k钙结合蛋白基因克隆序列分析真核表达
分类号: Q782
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
下　载: 157次
引　用: 3次
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内容摘要

D28k钙结合蛋白(CaBP-D28k)是受活性维生素D调节的细胞内蛋白质，它与CaBP-D9k统称为维生素D依赖性钙结合蛋白(CaBP-Ds)，与钙有高亲合力，在小肠和肾脏钙的细胞内转运过程中起着非常重要的作用。对CaBP-D28k进行深入、细致的研究是营养与生理等学科的重要课题，有着极高的学术价值与实用前景。本研究拟利用分子生物学技术构建鸡CaBP-D28k的真核表达质粒，在鸡体内进行表达并以此来对禽体内钙的营养调控机制进行研究，并进一步寻找利用基因注射来解决生产中由于钙的营养不足而引起的各种缺乏病的可行性。本研究是对CaBP-D28k作用的初步探讨，旨在为CaBP-D28k的进一步研究、开发奠定基础，通过RT-PCR的方法从蛋鸡小肠组织RNA扩增出789bp完整的鸡CaBP-D28kcDNA。通过TA克隆，我们将所扩增的cDNA克隆入载体pGEM-T内，经酶切和PCR初步鉴定后，再测定分析其序列的正确性。为了验证克隆的鸡CaBP-D28k cDNA的编码情况，本研究通过将鸡CaBP-D28k cDNA亚克隆入真核表达载体pCEP4内，构建了真核表达构件pCEP4-CaBP-D28k，用所获得的真核表达构件pCEP4-CaBP-D28k转染COS-1细胞，进行暂态表达，用免疫荧光法检测到表达产物。用真核表达构件pCEP4-CaBP-D28k注射老年蛋鸡，经血液中降钙素、甲状旁腺素、雌二醇和血钙血磷的测定分析，检验重组真核表达质粒在蛋鸡体内的表达情况。本研究得到的结果显示： 1．鸡CaBP-D28k cDNA的全序列分析表明，RT-PCR方法克隆得到的CaBP-D28k cDNA与国外已发表的序列相比仅有1个碱基的差别，中间没有缺失和插入现象，证明所得到的是鸡的D28k钙结合蛋白。DNA。 2.对构建的真核表达构件pCEP4一CaBP-D28k进行酶切和PCR鉴定，证明得到了重组的鸡D28k钙结合蛋白基因真核表达质粒。 3.免疫荧光法检测真核表达质粒转染COS一l细胞后的表达情况，图形清晰可见，证明重组真核表达质粒能够正常表达，且表达产量较高。 4.蛋鸡体内表达实验结果表明，在整个实验过程中，注射重组表达质粒的实验组动物其血钙水平明显上升，血液中降钙素显著上升;血磷水平稍有降低，血液中申状旁腺素、雌二醇明显下降，且变化幅度明显大于对照组动物。

全文目录

符号说明  7-8
前言  8-11
本次实验的目的意义及内容  11-12
CaBP-D28k研究(综述)  12-31
实验一鸡CaBP-D28k基因的克隆和序列分析  31-39
  1 材料  31
  2 方法  31-33
  3 结果与分析  33-38
  4 讨论  38-39
实验二鸡CaBP-D28k重组真核表达质粒的构建和细胞表达  39-45
  1 材料  39
  2 方法  39-42
  3 结果与分析  42-44
  4 讨论  44-45
实验三鸡CaBP-D28k重组真核表达质粒在蛋鸡体内的表达  45-53
  1 材料  45
  2 方法  45-46
  3 结果与分析  46-50
  4 讨论  50-53
小结  53-54
结论与创新  54-55
参考文献  55-59
致谢  59
发表论文  59-61

D28k钙结合蛋白基因真核表达质粒的构建及其表达效果的研究

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