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克螟稻中cry1Ab基因表达产物在土壤中的环境行为

作　者: 吴立成
导　师: 叶庆富
学　校: 浙江大学
专　业: 生物物理学
关键词: 转Bt(cry1Ab)基因水稻 Bt蛋白 土壤 环境行为 标记基因 水平转移
分类号: S511
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
下　载: 109次
引　用: 2次
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内容摘要


本文以转Bt（cry1Ab）基因水稻-克螟稻（KMD）及其亲本水稻-秀水11（Xiushui 11）为试材，通过田间和实验室试验，研究了克螟稻生育期间Bt蛋白的表达、分泌、土壤中的残留及秸秆还土后Bt蛋白在土壤中的降解规律；同时从克螟稻秸秆中纯化制备出Bt纯蛋白，进而研究该蛋白在不同土壤中的吸附解吸与降解规律。试验中还对抗性选择标记基因（nptⅡ、hpt）水平转移到土壤细菌的可能性进行了初步探讨。主要结果如下： 1)Bt蛋白纯化制备和土壤中Bt蛋白提取方法的建立 采用0.1M Na2CO3-NaHCO3+5.0mM DTT缓冲液作为提取剂以提取克螟稻秸秆中的Bt蛋白。提取液经冷冻干燥浓缩和截留分子量浓缩至较小体积，然后用（NH4）2SO4分级沉淀（20％去杂蛋白，80％收集Bt粗蛋白）、离子交换色谱（A-50）、凝胶渗透色谱（G-150）等步骤后，得到了纯度较高的Bt蛋白（经SDS-PAGE电泳检测相对纯度80％以上）。生物活性测定表明，纯化制备所得的Bt纯蛋白仍保留杀虫活性。 国内外现有的方法难以有效地提取土壤中的Bt蛋白（提取效率4.6～35％），为研究Bt蛋白在土壤环境中的行为与归趋，建立适宜的提取方法尤为重要。本研究通过添加回收率试验（分别添加Bt纯蛋白和克螟稻秸秆），比较了3种提取方法对不同土壤中Bt蛋白的提取效率，得出了适用于从土壤中提取Bt蛋白的方法。利用新建的提取方法，土壤中Bt纯蛋白的添加回收率在46.18～81.73％之间；克螟稻秸秆还土后，秸秆中的Bt蛋白的提取回收效率在47.72～82.25％之间。新方法的提取效率明显高于Palm等法（提取效率7.25～34.15％）和Environlogic公司方法（提取效率4.61～21.32％）。某些土壤中Bt蛋白的提取效率相对较低，意味着Bt蛋白易与该土壤基质（粘土矿物和腐殖质等）形成难以提取的结合态残留，这进一步证实了Stotzky等人的研究结果。 2)Bt纯蛋白和克螟稻秸秆中的Bt蛋白在土壤中的降解规律 Bt纯蛋白的添加培养试验表明，在7种不同土壤中其降解趋势符合一级动力学反应方程Y=Y0e-λt，半减期为15.2～97.6d，培养前期（30d前）降解比较快，而后缓慢降低。Bt纯蛋白在粗砂土降解最慢，半减期为97.6d；而在滨海盐土和盐碱土中降解最快，半减期分别为19.6d和15.2d；当Bt纯蛋白的添加量为1.25μg／g时，粗砂土培养345d后仍然能够检测到Bt蛋白。试验结果还表明，所有培养土壤中，Bt纯蛋白的持留时间都大干150d。浙江大学硕士学位论文 克螟稻秸秆添加试验表明，克螟稻秸秆中的Bt蛋白在5种不同土壤中的降解趋势符合一级动力学反应方程Y=Yoe一“，半减期为10.7一32.ld，培养前期（20d前）降解比较快，而后缓慢降低。当克螟稻秸秆添加量为4%时，Bt蛋白在黄松土、小粉土、黄筋泥和红砂土中的半减期分别为15.2d、20.ld、32.ld和31.ld，其在后两种土壤中降解较慢，培养146d和138d后仍然能够检测到Bt蛋白存在。而在滨海盐土中，Bt蛋白降解最快，半减期仅为10.7d，培养60d后Bt蛋白浓度就低于检测限检测极限（0.5n岁g.air dried5011）。试验结果还表明，培养150d后，所有供试土壤中均检测不到Bt蛋白。3) Bt纯蛋白在土壤中的吸附解吸规律 Bt纯蛋白在土壤中的吸附率随着Bt蛋白加入浓度的降低而升高（浓度125一780n留mL）。在7种供试土壤中，小粉土的吸附率最高，Bt蛋白浓度为125和780ng/mL时，其吸附率分别为24.9%和40.8%;而黄松土和滨海盐土的吸附率相对最低，相应的吸附率分别为9.1%和31.7%，12.5%和30.8%。解吸附率随着吸附量的减少而降低。小粉土的解吸附率较低，分别为13.0%和5.9%。土壤对Bt纯蛋白的单位吸附量与Bt蛋白加入浓度和土壤的OM呈显著正相关（P<0.05）。4)生育期间克螟稻Bt蛋白的表达、分泌与根际土中的残留规律 分粟始期至成熟期，克螟稻地上部和根中Bt蛋白的表达量分别为3.23一8.22“g/s.FW和0.68一0.89协g/g.FW。克螟稻根系分泌的Bt蛋白量仅为1.66一48.02 ng/individual·d，根际土中的Bt蛋白的残留量低于检测限（0 .sn岁9 air-dried 5011）。生物测定还表明，克螟稻根际土及其提取液对棉铃虫（Heliochis armigera）初孵幼虫和3龄幼虫不产生致死性效应。因此，从Bt蛋白的空间转移角度分析，只要能防治克螟稻秸秆还田，生育期间根系分泌的Bt蛋白难以转移到土壤中，对敏感生物也不会造成危害。5)克螟稻生育期间和秸秆还土后抗性标记基因水平转移的可能性 对抽提土壤细菌DNA的方法进行了比较和改进，改良方法抽提的土壤细菌DNA的A26夕凡80为1.61，A260/A23。为0.86，在一定程度上优化了提取质量与得率。用该方法分别研究了连续多年种植克螟稻的田间土壤细菌和添加秸秆实验室培养的土壤细菌的DNA分子图谱，试验结果表明，在土壤细菌DNA中均没有扩增到抗性标记基因（nPtll、hPt）的片段，即未发现克螟稻中与目的基因（c尽]Ab）相串联的抗性标记基因（nPtll、如t）水平转移到土壤细菌中。明确的结论还有待于进一步的试验证实。

全文目录


致谢  11-12
摘要(中文)  12-14
摘要(英文)  14-16
第一部分 绪论  16-50
  第一章 文献综述  17-47
    第一节 Bt基因及转Bt基因植物研究进展  17-27
      1 Bt基因和转Bt基因植物  17-21
        1.1 Bt杀虫晶体蛋白的结构和杀虫机理  17-19
        1.2 Bt杀虫晶体蛋白基因的分类  19-21
      2 转Bt基因植物及转基因育种  21-27
        2.1 转Bt基因植物的应用前景  21-22
        2.2 转Bt基因植物的培育  22-25
        2.3 转Bt基因植物的商品化应用  25-27
    第二节 转基因植物的风险性及对策  27-47
      1 转基因植物的食品安全性  28-31
        1.1 毒性分析(外源基因及其编码的蛋白)  28-30
          1.1.1 外源基因的直接毒性  28-29
          1.1.2 外源基因编码的蛋白的毒性  29-30
        1.2 过敏性分析  30-31
          1.2.1 过敏性食物  30-31
        1.3 抗抗生素标记的安全性  31
          1.3.1 产生抗菌素耐药性细菌  31
      2 转基因植物的环境生态风险性  31-47
        2.1 转基因植物入侵危害(遗传污染)  31-34
          2.1.1 抗除草剂植物的商品化和抗除草剂基因的漂移  31-32
          2.1.2 抗病基因、病毒、微生物的重组和异源包装  32-33
          2.1.3 抗抗生素标记基因的扩散  33-34
        2.2 转基因植物对非靶标生物影响  34-39
          2.2.1 转基因抗虫植物对天敌的影响  34-39
            2.2.1.1 对捕食性天敌昆虫的影响  35-36
            2.2.1.2 对寄生性天敌昆虫的影响  36-38
            2.2.1.3 对其它天敌和非靶标生物种群动态的影响  38-39
        2.3 转基因抗虫植物对靶标生物的影响及抗性治理  39-43
          2.3.1 靶标生物产生抗性  39
          2.3.2 害虫对转抗虫基因植物抗性的治理策略  39-43
            2.3.2.1 多毒素策略  40
            2.3.2.2 高表达与低表达策略  40-41
            2.3.2.3 避难区策略  41-42
            2.3.2.4 特异性或诱导性启动表达  42-43
            2.3.2.5 其它策略  43
        2.4 转基因抗虫植物对土壤微生物的影响  43-47
          2.4.1 Bt基因植物所表达的Bt蛋白在土壤中的行为  43-44
          2.4.2 Bt基因植物所表达的Bt蛋白对土壤生物的影响  44-47
  第二章 选题依据、研究内容及目的意义  47-50
    1 选题依据  47-48
    2 研究目的和意义  48
    3 研究内容  48-50
第二部分 方法  50-71
  第三章 从克螟稻秸秆中高效纯化制备Bt(Cry1Ab)蛋白的方法  51-58
    1 材料与方法  51-53
      1.1 试剂与药品  51
      1.2 供试水稻样品  51-52
      1.3 试验方法  52-53
    2 结果与分析  53-57
      2.1 (NH_4)_2SO_4饱和度对Bt蛋白沉淀量的影响  53-54
      2.2 Bt蛋白的纯化与测定  54-56
      2.3 Bt蛋白的生物学活性  56-57
    3 结论  57-58
  第四章 从土壤中高效提取Bt(Cry1Ab)蛋白的方法  58-63
    1 材料与方法  58-60
      1.1 试剂与药品  58
      1.2 试验样品  58-59
        1.2.1 供试土壤样品  58-59
        1.2.2 供试水稻样品  59
      1.3 试验方法  59-60
        1.3.1 克螟稻秸秆中Bt蛋白的提取纯化  59
        1.3.2 源于克螟稻的纯Bt蛋白在土壤中的添加回收率测定  59
        1.3.3 克螟稻秸秆加入土壤后Bt蛋白提取效率的测定  59-60
    2 结果与分析  60-62
      2.1 从土壤中提取Bt蛋白的效率和添加回收率  60-62
    3 讨论  62-63
  第五章 土壤细菌中DNA的提取方法  63-71
    1 材料与方法  63-66
      1.1 试剂与药品  63
      1.2 供试土壤样品  63-64
      1.3 细菌收集  64
        1.3.1 偏磷酸钠-Chrombach缓冲液法  64
        1.3.2 磷酸钠缓冲液法  64
        1.3.3 TE缓冲液-偏磷酸钠-TE缓冲液法  64
      1.4 细菌裂解方法  64-65
        1.4.1 溶菌酶-蛋白酶K-SDS／Chrombsch缓冲液法  64-65
        1.4.2 溶菌酶-蛋白酶K-SDS／Tris-EDTA缓冲液法  65
        1.4.3 CTAB-溶菌酶-蛋白酶K法  65
      1.5 DNA收集方法  65-66
        1.5.1 氯化钾-异丙醇沉淀法  65
        1.5.2 醋酸钠-乙醇沉淀法  65-66
      1.6 RNase的处理方法  66
      1.7 DNA质量检测与定量  66
    2 结果与分析  66-70
      2.1 不同方法抽提土壤细菌DNA  66-67
      2.2 不同条件对抽提效率的影响  67-68
      2.3 修饰步骤的影响  68-70
      2.4 最佳提取方案  70
    3 讨论  70-71
第三部分 试验  71-100
  第六章 源于克螟稻的纯Bt(Cry1Ab)蛋白在土壤中的吸附解吸与降解  72-81
    1 材料与方法  72-75
      1.1 试验器材  72
        1.1.1 试剂与药品  72
      1.2 试验样品  72-73
        1.2.1 供试土壤样品  72-73
      1.3 试验方法  73-75
        1.3.1 源于克螟稻的纯Bt蛋白在不同类型土壤中的吸附解吸  73-74
          1.3.1.1 吸附试验  73-74
          1.3.1.2 解吸附试验  74
        1.3.2 纯Bt蛋白在不同类型土壤中的降解  74-75
    2 结果与分析  75-80
      2.1 纯Bt蛋白在7种土壤中的吸附解吸  75-78
      2.2 纯Bt蛋白在7种土壤中的降解  78-80
    3 讨论  80-81
  第七章 克螟稻秸秆还土后Bt(Cry1Ab)蛋白在土壤中的降解  81-87
    1 材料与方法  81-83
      1.1 试验器材  81
        1.1.1 试剂与药品  81
      1.2 试验样品  81-82
        1.2.1 供试土壤样品  81-82
        1.2.2 供试水稻样品  82
      1.3 试验方法  82-83
        1.3.1 克螟稻秸秆中的Bt蛋白在土壤中的降解  82-83
    2 结果与分析  83-85
      2.1 克螟稻秸秆中的Bt蛋白在5种土壤中的降解  83-85
    3 讨论  85-87
  第八章 生育期间克螟稻中Bt(Cry1Ab)蛋白的时空表达、根系分泌及其在土壤中的残留  87-95
    1 材料与方法  87-89
      1.1 供试材料  87
      1.2 试验方法  87-89
        1.2.1 水稻田间培养及根系和地上部Bt蛋白的测定  87-88
        1.2.2 水稻根际土中Bt蛋白的提取与测定  88
        1.2.3 水稻根系分泌物中Bt蛋白的测定  88
        1.2.4 根际土及其提取液对棉铃虫的致死率分析  88-89
    2 结果与分析  89-93
      2.1 克螟稻植株地上部和根系中Bt蛋白随时间的变化规律  89-90
      2.2 克螟稻中Bt蛋白的分泌规律及其在根际土中的积累  90-91
      2.3 克螟稻根际土及其提取物对棉铃虫的致死效应  91-93
    3 讨论  93-95
  第九章 抗性标记基因(nptⅡ和hpt)在克螟稻生育期间和秸秆还土后向土壤细菌水平转移的可能性初探  95-100
    1 材料与方法  95-97
      1.1 试剂与药品  95
      1.2 供试土壤样品  95-96
      1.3 方法  96-97
        1.3.1 PCR引物设计  96
        1.3.2 土壤细菌中总DNA的提取  96
        1.3.3 克螟稻中总DNA的提取  96
        1.3.4 PCR扩增目的基因片段  96-97
    2 结果与分析  97-98
      2.1 分别从克螟稻和土壤细菌DNA中扩增2种抗性标记基因  97-98
    3 讨论  98-100
总结  100-102
参考文献  102-115

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 稻
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