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Cpn0810基因克隆与表达及诱导THP-1细胞产生前炎症细胞因子和凋亡的研究

作　者: 陈玉玉
导　师: 吴移谋
学　校: 南华大学
专　业: 病原生物学
关键词: Cpn0810 THP-1细胞前炎症细胞因子细胞凋亡
分类号: R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 21次
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内容摘要

目的:构建重组质粒pGEX6p-2/Cpn0810,在E.coli BL21中进行诱导表达,纯化获得重组融合蛋白Cpn0810。研究该重组蛋白在体外诱导人单核细胞产生前炎症细胞因子TNF-α和IL-6的水平及诱导细胞凋亡的作用,为进一步探索Cpn感染致病的分子机制提供实验依据。方法:PCR扩增Cpn0810蛋白编码基因,构建pGEX6p-2/Cpn0810重组质粒,测序正确后在E.coli BL21中诱导表达,用SDS-PAGE和Western-Blot进行分析和鉴定。用ToxinEraser纯化柱去除内毒素后用不同浓度的GST-Cpn 0810刺激THP-1细胞;ELISA法检测经刺激后的THP-1细胞产生的TNF-α和IL-6水平;以WST-1法检测经GST-Cpn0810处理后对THP-1细胞的增生或抑制作用;用Hoechst33258荧光染色、AnnexinV-FITC-PI染色法检测细胞凋亡情况。结果:构建了重组质粒pGEX6p-2/ Cpn0810,并在E.coli BL21菌中高效表达出Mr约为42kDa的GST-Cpn 0810目的蛋白,超声裂解后SDS-PAGE分析目的蛋白在菌体细胞内以可溶性形式表达,经采用默克Novagen的GST纯化树脂纯化获得纯度在95%以上的重组蛋白。GST-Cpn 0810能诱导THP-1细胞表达TNF-α和IL-6,并以时间、剂量依赖方式刺激细胞分泌前炎症细胞因子TNF-α和IL-6,当GST- Cpn0810的浓度为4μg/mL时产生的TNF-α和IL-6量最多,分别为(184.75±17.40)pg/mL、(75.36±29.49)pg/mL;当GST-Cpn 0810刺激THP-1细胞24h时产生的TNF-α和IL-6量则达到高峰。另外GST-Cpn 0810以剂量依赖方式抑制THP-1细胞增殖。当10μg/mL GST-Cpn处理THP-1细胞24h后,形态学上,细胞表现为皱缩、核碎裂、细胞起泡及凋亡小体等凋亡特征。结论:1.成功克隆Cpn0810基因并构建了pGEX6p-2/ Cpn0810原核表达载体,将其转化至E.coli BL21后能高效表达出一相对分子质量约42kDa的GST- Cpn0810融合蛋白;2. Cpn0810蛋白能诱导THP-1细胞表达并分泌前炎症细胞因子TNF-α和IL-6;3. Cpn 0810蛋白既能抑制THP-1细胞增殖,又能诱导其凋亡。

全文目录

一、主要缩略语英文索引  4-6
二、中文摘要  6-8
三、英文摘要  8-11
四、正文  11-43
  前言  11-14
  实验材料  14-16
  实验方法  16-27
  实验结果  27-38
  讨论  38-42
  结论  42-43
五、参考文献  43-47
六、附录  47-49
七、文献综述  49-57
八、成果目录  57-58
九、致谢  58

Cpn0810基因克隆与表达及诱导THP-1细胞产生前炎症细胞因子和凋亡的研究

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