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环介导等温核酸扩增技术（LAMP）在霍乱弧菌快速检测中的应用与研究

作　者: 燕勇
导　师: 朱心强
学　校: 浙江大学
专　业: 食品卫生学
关键词: 霍乱霍乱弧菌环介导等温核酸扩增技术(LAMP) PCR 引物设计快速检测
分类号: R440
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

研究目的霍乱弧菌是严重威胁着人们健康的重要肠道致病菌,在我国被列为甲类“2号”传染病原菌,每年卫生部门花费大量人力物力用于霍乱的疾病预防与病原检测。本研究就是利用LAMP技术开发、建立快速、可靠、简便的霍乱弧菌检测方法,以便于在基层单位推广使用,为霍乱疫情监测与预防提供更为及时的应急检测服务和参考结果。研究主要内容和方法通过参阅文献资料,研究LAMP的技术细节与过程,确定特异的霍乱弧菌基因作为目标基因,建立基础的LAMP反应实验体系。通过Genbank检索、下载霍乱弧菌基因序列,使用BLAST、GENtle、DNAMan等相关核酸序列分析软件比对分析确定具有鉴定意义的霍乱弧菌基因序列作为目标序列,使用专门的LAMP引物设计软件PrimerExplorer v4针对目标序列设计特异的霍乱弧菌LAMP引物。以SYBR Green I作为荧光剂在荧光定量PCR仪上实时检测LAMP反应结果,作为本研究开发、建立霍乱弧菌的LAMP快速检测方法的主要研究方式。通过优化反应温度、时间、组成浓度等实验条件对LAMP检测方法进行改进。通过与传统的分离培养鉴定方法和PCR方法比较进行方法学评价,前者为霍乱防治手册(卫生部1996年)规定的常规方法,后者系以霍乱弧菌ace, rtxA和ctxA为目标基因的普通PCR方法。研究结果本研究建立的霍乱弧菌LAMP快速检测方法以霍乱弧菌的外分泌蛋白系统M亚单位的编码基因epsM和霍乱毒素A亚单位的编码基因ctxA为目标基因,前者具有良好的霍乱弧菌种特异性,后者用于检测产霍乱毒素的霍乱弧菌菌株。本方法使用epsM引物和ctxA引物,从8个种属的20株实验菌株中分别正确地检出所有13株霍乱弧菌菌株和所有5株产霍乱毒素的霍乱弧菌菌株,对菌株纯培养物的检出限分别达到了12.5cfu/μl(25cfu/reaction)和5cfu/μl(10cfu/reaction),明显低于其它比较的两种方法,尤其传统的分离培养方法,PCR方法的检出限分别为100cfu/reaction(rtxA)和50 cfu/reaction(ctsA)。方法学评价方面,从75份实际样品的检测结果来看,本研究建立的LAMP方法与比较的PCR方法的霍乱弧菌检出率没有明显差异(x2=0.500,P>0.05,α2-side=0.05, Kappa=0.894),但两者明显高于传统的分离培养鉴定方法(P<0.05,α2-side=0.05)。结论与传统的分离培养鉴定方法相比,本研究建立的LAMP检测方法和比较的PCR方法检测霍乱弧菌均具有更高的特异性和灵敏度,但LAMP检测方法比后者更为快速,在1h内可完成扩增反应,而且操作更为简单方便,由于等温扩增不需要诸如PCR仪等特殊仪器。因此,本研究建立的霍乱弧菌LAMP检测方法是一种更为快速、简便、可靠的霍乱弧菌快速检测方法,适于基层单位推广使用,对霍乱疾病监测与暴发后疫情应急检测具有重要意义。

全文目录

致谢  4-5
中文摘要  5-7
Abstract  7-9
目次  9-11
1 引言  11-16
  1.1 霍乱及其病原简介  11
  1.2 霍乱病原检测的现状  11-12
  1.3 环介导等温核酸扩增技术(LAMP)及其应用  12-13
  1.4 研究目的与内容  13-14
  1.5 本研究有关术语  14-16
2 材料与方法  16-24
  2.1 实验材料  16-17
  2.2 研究方法  17-24
3 结果与分析  24-33
  3.1 DNA基因组提取方法的比较  24
  3.2 霍乱弧菌LAMP反应条件的优化  24-28
  3.3 霍乱弧菌LAMP检测方法的评价  28-33
4 讨论  33-37
  4.1 霍乱弧菌LAMP的目标基因  33-34
  4.2 霍乱弧菌DNA提取方法  34
  4.3 霍乱弧菌LAMP的优化  34
  4.4 霍乱弧菌LAMP的统计学评价  34-35
  4.5 霍乱弧菌LAMP的特点与总结  35-37
5 结论与建议  37-39
参考文献  39-43
综述  43-52
  参考文献  49-52
作者简介及在学期间所取得的科研成果  52-53

环介导等温核酸扩增技术（LAMP）在霍乱弧菌快速检测中的应用与研究

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