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受损心肌细胞通过与骨髓干细胞融合而避免凋亡

作　者: 杨伟健
导　师: 刘世明
学　校: 广州医学院
专　业: 心血管内科学
关键词: 初生心肌细胞 骨髓间充质干细胞 骨髓造血干细胞 细胞融合 细胞因子 氧化应激 凋亡
分类号: R541.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


冠状动脉粥样硬化性心脏病的患者,其冠状动脉管腔由于粥样硬化而狭窄或阻塞,导致心肌缺血和缺氧。无论是冠心病造成的心肌缺血缺氧,还是我们现代再灌注治疗涉及到的再灌注损伤,都会造成心肌的凋亡及坏死。而自由基的氧化应激在其中发挥了重要的作用。骨髓干细胞是成体干细胞其中一员。它们包括了骨髓间充质干细胞及骨髓造血干细胞。它们都具有多能分化的特性,与组织修复有关。骨髓间充质干细胞至少可分化为软骨、成骨细胞、脂肪细胞及平滑肌细胞,有研究更发现其可分化为心肌样细胞。骨髓造血细胞可分化成各种血细胞及非血细胞。近年骨髓干细胞心脏移植已被证明可以改善受损心脏的功能。其机理可能和以下几方面有关:促进血管生成,改善心脏的血液循环;分泌细胞因子,改善心肌微环境;干细胞再生为心肌细胞,补充了心肌细胞的数量。近年研究发现骨髓干细胞可以与肝脏细胞、神经细胞及人热休克小气道内皮细胞融合。而骨髓干细胞与心肌细胞的融合仍有待研究。于是我们假设:心肌细胞与骨髓干细胞融合,是心肌细胞避免凋亡的一种生存方式。为了证实假设,我们设计了离体和活体实验。离体实验是在原代心肌细胞培养液里加入过氧化氢,使心肌细胞趋向于凋亡,将骨髓干细胞按一定比例加入到受损的心肌细胞里共培养。检测细胞融合及凋亡的情况;活体实验是将RFP阳性小鼠作左前降支结扎术,立即将GFP阳性的骨髓间充质干细胞直接注射到坏死区边缘,一周后检测心肌内细胞融合的情况。【方法】1.大鼠原代初生工作心肌细胞的获取、培养、标记及过氧化氢处理;2.大鼠骨髓间充质干细胞及造血干细胞的获取、培养、鉴定;3. TUNEL检测凋亡;4. Annexin V检测凋亡;5.小鼠急性心肌梗死模型的建立、细胞移植及心脏消化。【结果】1.氧化应激作用造成心肌细胞凋亡(TUNEL及Annexin V检测):1)心肌细胞经过过氧化氢处理后,凋亡明显比对照组(未经过氧化氢处理)多,P<0.05;2)25mmol/L与50mmol/L过氧化氢造成心肌细胞凋亡的效果相当,P>0.05;3)心肌细胞经过过氧化氢处理后,分别在48小时、72小时与96小时后检测其凋亡情况,结果无统计学差别,P>0.05;2.骨髓间充质干细胞与氧化应激受损的心肌细胞融合(荧光显微镜及流式细胞仪):1)荧光显微镜:a.细胞固定及荧光染色后于荧光显微镜下观察发现融合细胞;b.活细胞于荧光显微镜下动态观察:心肌细胞自融合;骨髓间充质干细胞自融合;骨髓间充质干细胞与心肌细胞融合;2)流式细胞仪:a.骨髓间充质干细胞只与氧化应激受损的心肌细胞融合(过氧化氢作用组),不与没氧化应激的心肌细胞融合(对照组),P<0.05;b.两种细胞的融合率跟随过氧化氢浓度梯度变化而变化;c.两种细胞的融合率跟随共培养时间长度变化而变化。3.氧化应激受损的心肌细胞通过与骨髓间充质干细胞融合而改善生存(TUNEL及Annexin V检测):1) TUNEL:共培养组心肌细胞的凋亡率(19%)明显低于对照组(非共培养组)(8.4 %),降低55.8%,P<0.05;2) Annexin V:a.共培养组在共培养48、72及96小时后心肌细胞的凋亡率分别是9.3%, 7.6%, 5.6%,低于对照组(非共培养组)(11.9%),分别降低了:21.8%,36.%,52.9%,P<0.05;b.两种细胞融合率与心肌细胞凋亡率之间的相关性:心肌细胞的凋亡率随着融合率的升高而降低,相关系数R2=0.9901。4.氧化应激受损的心肌细胞与骨髓造血干细胞融合(荧光显微镜及流式细仪):1)造血干细胞的鉴定:从免疫磁性细胞分离法获得的骨髓造血干细胞经流式细胞仪检测,CD90.1阳性率是98%;2)荧光显微镜:细胞固定及荧光染色后于荧光显微镜下观察发现融合细胞。3)流式细胞仪:a.骨髓造血干细胞与氧化应激受损的心肌细胞融合,不与没氧化应激的心肌细胞融合(对照组),P<0.05;b.骨髓造血干细胞与氧化应激受损的心肌细胞的融合率(10.7%)高于骨髓间充质干细胞与与氧化应激受损的心肌细胞的融合率(7.9%),P<0.05;5.氧化应激受损的心肌细胞通过与骨髓造血干细胞融合而改善生存(Annexin V):1)氧化应激受损的心肌细胞与骨髓造血干细胞共培养组心肌细胞的凋亡率(6.5%)低于非共培养组(10.4%),降低了37.5%,P<0.05;2)氧化应激受损的心肌细胞通过与骨髓造血干细胞融合而改善生存的效果等同于与骨髓间充质干细胞融合而改善生存的效果。P>0.05。6.只有受损的心肌工作细胞才与骨髓间充质干细胞发生融合(流式细胞仪):氧化应激受损的心血管平滑肌细胞及成纤维细胞与骨髓间充质干细胞的融合率均为零。7.细胞因子TNF-α、IL-11、SCF能影响受损心肌与骨髓间充质干细胞的融合:1) TNF-α组的融合率(5.7%)较对照组(没加入细胞因子组)的融合率(7.9%)降低,P<0.05;2) IL-11组的融合率(10.2%)较对照组增高,P<0.05;3) SCF组的融合率(11.2%)较对照组增高,P<0.05。8.活体实验证明了受损心肌细胞与骨髓干细胞发生融合的现象(流式细胞仪):1)小鼠心脏接受LAD结扎术后,于心肌直接注射骨髓间充质干细胞,其融合率达8.8%;2)小鼠心脏未接受LAD结扎术,开胸后于心肌直接注射骨髓间充质干细胞,其融合率达4.7%;3)小鼠心脏接受LAD结扎术后,于心肌直接注射溶液,其融合率为0.03%。各组之间存在统计学差异,P<0.05。【结论】1.骨髓干细胞(骨髓间充质干细胞、骨髓造血干细胞)与氧化应激受损的心肌细胞(主要是工作细胞)融合,并且使心肌细胞减少凋亡、改善生存。2.细胞融合可能是组织应对损伤的一种修复方式。治疗细胞的来源主要是骨髓干细胞,也可能来自组织干细胞。细胞融合有助于解释干细胞转化及修复损伤的作用。3.活体实验骨髓间充质干细胞与心肌细胞间的融合证明了体外试验的结论,并为骨髓干细胞移植后心功能改善提供了一种解释。4.融合细胞的特性,如电生理、心肌功能蛋白的表达等仍需要深入研究。

全文目录


摘要  5-9
ABSTRACT  9-15
前言  15-16
材料与方法  16-22
结果  22-37
讨论  37-39
结论  39-40
参考文献  40-43
综述  43-50
  综述参考文献  47-50
致谢  50

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 心脏、血管（循环系）疾病 > 心脏疾病 > 冠状动脉（粥样）硬化性心脏病（冠心病）
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