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橘红心白菜和普通大白菜类胡萝卜素代谢途径主要酶基因的表达分析

作　者: 熊玉兰
导　师: 曹鸣庆；马荣才
学　校: 首都师范大学
专　业: 遗传学
关键词: 大白菜类胡萝卜素生物合成基因表达 RT-PCR Southern杂交高效液相色谱(HPLC)
分类号: Q946
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
下　载: 225次
引　用: 5次
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内容摘要

大白菜原产于我国，是我国重要的蔬菜作物。大白菜叶球是主要的食用部分，储存了丰富的营养物质。由北京农科院蔬菜研究中心选育的高营养品质“北京橘红心”大白菜叶球为橘红色，其类胡萝卜素含量远高于普通大白菜。为了在分子水平上揭示橘红心大白菜叶球呈橘红色的机理，本研究比较分析了在结球时期橘红心大白菜和普通大白菜中类胡萝卜素代谢途径中9个主要酶基因的表达水平。根据已经发表的有关酶的基因序列，设计合成了80对简并引物。通过设定三段退火温度，从中筛选出9对特异性较强的引物，并摸索出这9对引物最佳扩增条件。通过RT—PCR和Southern杂交检测技术，对橘红心大白菜和普通大白菜中类胡萝卜素代谢途径中9个主要酶基因的表达进行比较分析，结果显示，这9个主要的酶基因在两种大白菜中都存在，并都有表达。同时，对橘红心大白菜和普通大白菜共8个材料进行高效液相色谱(HPLC)分析，结果表明，5个橘红心材料中均含大量的番茄红素，而普通白菜均未检测到；叶黄素(Lutein)、B—胡萝卜素含量在两种材料中无明显差别；两种材料均未检测到α—胡萝卜素；在类胡萝卜素总量上，橘红心大白菜是普通大白菜的7倍。综合这些结果和前人的研究，可以推论：在结球期，橘红心大白菜中GGPS、PSY、PDS和ZDS的表达量要高于普通大白菜；β—LYS和ε—LYS的表达有可能低于或相等于普通大白菜；VDE和ZEP的表达在两种材料中有无差别有待进一步研究。该研究工作需进一步对9个酶基因的表达做定量分析，以找到在橘红心白菜和普通白菜中类胡萝卜素代谢途径中主要酶基因表达的差异所在，从而分离影响类胡萝卜素合成的调控基因。本研究工作为大白菜和其他作物的分子育种和代谢工程打下了一定的基础。

全文目录

中文摘要  5-6
英文摘要  6-8
名词缩写  8-9
第一章前言  9-11
第二章文献综述  11-23
  类胡萝卜素的代谢途径及代谢工程研究进展  11-23
    一．类胡萝卜素的生物合成途径及其在细菌、真菌、藻类和高等植物中的比较  11-16
      （一）类胡萝卜素代谢途径概述  12-14
      （二）细菌、藻类、真菌和高等植物的类胡萝卜素代谢途径的比较  14-16
    二．类胡萝卜素代谢途径的主要酶和基因  16-18
    三．类胡萝卜素代谢工程  18-21
      （一）大肠杆菌和酵母菌中类胡萝卜素的基因工程  18-19
      （二）通过基因组合控制类胡萝卜素代谢途径  19-20
      （三）植物中类胡萝卜素合成的转基因操作  20-21
    四．类胡萝卜素代谢工程展望  21-23
第三章材料与方法  23-38
  一．材料  23
  二．主要仪器  23-24
  三．方法  24-38
    （一） RNA的提取（TE3D法）和DNaseI处理  24-25
      1． RNA提取：（TE3D法）  24
      2． DNaseI处理RNA样品  24-25
    （二） RT反应及RT-PCR反应  25-29
      1． RT反应  25
      2． RT-PCR反应  25-26
      3．简并引物的设计  26-29
    （三） Southern杂交  29-36
      1．探针的来源  29
      2．探针的获得  29-34
        （1）． GGPS，PSY，PDS，β—LYS，ε—LYS，BCH，VDE，ZEP探针的获得  30-32
          Ⅰ 感受态细胞的制备  30
          Ⅱ 质粒DNA的转化  30-31
          Ⅲ 质粒DNA的提取  31
          Ⅳ 酶切鉴定  31-32
          Ⅴ 琼脂糖中DNA的快速回收  32
        （2）． ZDS探针的获得  32-34
          Ⅰ 根据已发表的拟南芥中ZDS序列设计特异性引物  32
          Ⅱ 从本实验室已有的拟南芥基因组DNA中PCR扩增出特异片断  32-33
          Ⅲ PCR产物测序  33-34
      3．探针的标记  34
      4．电泳及转膜  34-35
      5． Southern杂交  35-36
      6．检测  36
    （四）高效液相色谱（HPLC）测定类胡萝卜素含量  36-38
      1．试剂  36
      2．仪器  36-37
      3．样品中类胡萝卜素的提取  37
      4．标准液的配制  37
      5．色谱条件  37
      6．类胡萝卜素含量的计算  37-38
第四章结果与分析  38-54
  （一） RNA的提取  38
  （二）简并引物的筛选  38-39
  （三）探针的获得  39-43
    1． GGPS，PSY，PDS，BCH，LYS，VDE，ZEP探针的回收  39-41
    2． ZDS探针的制备  41-43
  （四） RT-PCR及Southern杂交检测  43-47
  （五）高效液相色谱（HPLC）测定类胡萝卜素含量  47-54
    1．吸收波长的选择  47
    2．流动相的选择  47
    3．定性分析  47
    4．标准工作曲线  47-48
    5． 8个样品中类胡萝卜素含量  48-54
第五章讨论  54-59
  （一）本研究采用的技术特点  54
  （二）比较分析橘红心大白菜和普通大白菜成熟期即结球期类胡萝卜素合成途径中9个主要酶基因的表达  54-57
  （三）大白菜和其他植物中类胡萝卜素含量的比较  57-58
  （四）本研究下一步工作的开展  58-59
第六章主要结论  59-60
参考文献  60-66
致谢  66

橘红心白菜和普通大白菜类胡萝卜素代谢途径主要酶基因的表达分析

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