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吉西他滨对K562细胞增殖、凋亡及Bcr-Ab1 mRNA表达的影响

作　者: 范玮
导　师: 孙玲
学　校: 郑州大学
专　业: 内科学
关键词: 盐酸吉西他滨 K562细胞株细胞凋亡 Bcr-Abl融和基因
分类号: R733.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目的:慢性粒细胞白血病是一种发生于多能造血干细胞的恶性骨髓增生性疾病,占成人白血病的15%。在受累的细胞系中,可找到Ph染色体和(或)Bcr-Abl融和基因,其蛋白产物在慢性粒细胞白血病的发生发展过程中起着主要作用。慢粒中位生存期为3—5年,而急性变期为慢粒的终末期,临床表现与急性白血病类似,预后极差,目前治疗效果不满意,往往在数月内死亡。K-562是一种从一个慢粒急变期病人体内获得的红白血病细胞系,在慢粒急变期细胞的基础研究中发挥重要作用。盐酸吉西他滨(2-脱氧-2’,2-盐酸二氟脱氧胞苷(β-异构体))是一种新型嘧啶类核苷酸抗代谢肿瘤药物,主要作用于DNA合成期(S期)的肿瘤细胞,可以阻止G1期向S期的进展。吉西他滨的结构、性质和代谢途径与阿糖胞苷相似但其磷酸化效率比阿糖胞苷强。其作用机制:①吉西他滨二磷酸盐(dFdCDP)抑制核糖核苷酸还原酶,减少DNA合成修复所需的脱氧核苷酸量。②dFdCTP与dCTP竞争进入DNA链,一旦吉西他滨三磷酸盐分子插入DNA链,就能阻止DNA链的合成,而且DNA聚合酶不能去除掺入的dFdCTP,修复DNA链,DNA合成停止,导致细胞凋亡。目前已被广泛应用于实体瘤的治疗,因其疗效肯定,副作用小被美国FDA批准为非小细胞肺癌、胰腺癌以及乳腺癌的一线化疗药。最近国内外有一些关于核苷类似物作用于慢性粒细胞白血病单独或联合治疗的研究报导,寻求对伊马替尼耐药以及慢粒进展期治疗的新方法。本实验是以K-562白血病细胞系为研究对象,研究吉西他滨在一定浓度范围内能否诱导细胞凋亡,并且诱导凋亡过程中,致病基因Bcr—Abl基因mRNA表达的变化情况,从而观察吉西他滨对K-562细胞增殖凋亡以及Bcr—Abl基因mRNA表达的影响,并探讨其作用机制,为吉西他滨作用于慢粒急变期的治疗提供实验室依据。方法:1.采用水溶性四唑盐光吸收法(WST-1)检测0.1μg/ml、1.0μg/ml、10μg/ml的吉西他滨分别作用于K-562细胞12h、24h、48h、72h后细胞的增殖情况,计算增殖抑制率,并找出GEM作用于K-562细胞的最适时间和最适浓度。2.采用原位末端转移酶标记技术(TUNEL技术)检测10μg/ml吉西他滨作用于K-562细胞48h后细胞的凋亡情况。以细胞核内着棕黄色颗粒为阳性。每张涂片随机计数300个细胞,计数阳性细胞数,计算阳性率(阳性率=阳性细胞数/300×100%)。3.应用RT-PCR方法检测10μg/ml吉西他滨作用于K-562细胞48h后Bcr-AblmRNA表达的变化,阳性对照组为10μg/ml阿糖胞苷,空白对照组未加药物。4.所得结果应用SPSS10.0统计学软件处理,对计数资料采用χ~2检验,对计量资料,统计学数据用均数±标准差((?)±s)表示。以a=0.05为检验水准。结果:1盐酸吉西他滨对K562细胞增殖的影响:采用WST-1比色法检测结果显示:0.1mg/L、1.0mg/L、10mg/L的吉西他滨分别作用于K562细胞48h,结果显示,吉西他滨对K562细胞增殖有一定的抑制作用,其抑制率分别为18.7%,23.9%,29.3%,明显强于同浓度阿糖胞苷组;吉西他滨组间两两比较,抑制作用随浓度的增加而增强。其抑制作用的最佳作用浓度为10mg/L;进一步行组间两两比较,48h内随着作用时间的延长抑制率增加,但10mg/L吉西他滨48h与72h吉西他滨对K562细胞的抑制率无显著统计学差异。其抑制作用的最适作用时间为48h。本实验表明,吉西他滨具有抑制K-562细胞增殖的作用,其作用的最适浓度为10μg/ml,最适时间为48h。2吉西他滨对K562细胞的诱导凋亡作用:10mg/L吉西他滨作用于K562细胞48h后,TUNEL法检测阳性细胞数并计算阳性细胞率发现,吉西他滨对K562细胞有一定的诱导凋亡作用,阳性细胞数47,阳性率为15.3%,与空白对照组(阳性细胞数6,阳性率2.0%)和阿糖胞苷组(阳性细胞数11,阳性率3.7%)比较差异均具有统计学意义(P＜0.05)。而阿糖胞苷组和空白对照组比较差异无统计学意义。3吉西他滨对K562细胞Bcr-Abl融合基因表达的影响:RT—PCR扩增结果显示,作用48h后,10mg/L吉西他滨组,10mg/L阿糖胞苷组和空白组的Bcr-Abl相比条带灰度明显减弱,其融合基因mRNA的灰度值分别为0.12,0.15和0.40。与空白对照组相比,吉西他滨组降低了K562细胞Bcr-Abl融合基因mRNA的表达,和阿糖胞苷组相比没有统计学差异(t=1.389 P＞0.5)。结论:1吉西他滨对K562细胞有一定的增殖抑制作用,作用强于阿糖胞苷。2吉西他滨对K562细胞有一定的凋亡诱导作用,作用强于阿糖胞苷。2 10mg/L吉西他滨能够明显下调K562细胞Bcr-Abl融合基因mRNA的表达。

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摘要  3-6
Abstract  6-11
论文吉西他滨对K-562细胞增殖、凋亡及Bcr-Abl mRNA表达的影响  11-35
  前言  11-12
  材料和方法  12-23
  结果  23-27
  讨论  27-30
  结论  30
  展望  30-31
  参考文献  31-35
综述慢性粒细胞白血病的治疗现状与展望  35-55
  参考文献  45-55
英文缩略词表  55-56
致谢  56

吉西他滨对K562细胞增殖、凋亡及Bcr-Ab1 mRNA表达的影响

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