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亚洲型猪囊尾蚴3个低分子量抗原基因的克隆、表达及ELISA检测方法的建立

作　者: 王秋霞
导　师: 宁长申；张改平
学　校: 河南农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪囊尾蚴病 8kDa抗原家族 TsRS1基因 M13h基因 Ts8B2基因克隆表达蛋白纯化间接ELISA
分类号: S852.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 21次
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内容摘要

猪囊尾蚴病是一种重要的人畜共患寄生虫病,不仅引起猪肉品质下降,而且给人类健康造成重大危害。目前,低分子量抗原在猪囊尾蚴病的免疫诊断和免疫预防中的作用日益受到国内外学者的关注。本研究通过基因工程方法克隆了猪囊尾蚴8kDa抗原家族三个基因,并分别构建重组表达载体,进行高效表达；利用GST亲和层析方法分别纯化三种重组蛋白；并比较三种重组蛋白抗原性,选出抗原性最好者建立间接ELISA方法来检测猪囊尾蚴病抗体。为猪囊尾蚴病检测试纸条、试剂盒的研制提供重要参考依据。1、利用总RNA提取技术、反转录技术和PCR技术获得了猪囊尾蚴8KDa家族的排泄分泌抗原M13h基因、Ts8B2基因、小扁豆凝集素抗原TsRS1基因,长度分别为258bp、270bp和321bp,分别克隆入pMD19-T并测序。2、将测序正确的三种基因成熟肽部分分别亚克隆入原核表达载体pGEX-6p-1中,构建重组表达载体pGEX-6p-1/TsRS1、pGEX-6p-1/Ts8B2、pGEX-6p-1/M13h;经过PCR扩增和双酶切鉴定及测序分析,证明该基因正确插入到表达载体中,且阅读框正确。将三种重组质粒转化BL21(DE3)宿主菌中进行原核表达,利用SDS-PAGE和Western blot检测表达产物。结果表明：成功构建了三种表达载体,并在大肠杆菌中高效表达了三种蛋白；经Western blot证明三种表达蛋白均可被兔抗猪囊尾蚴囊液多抗血清特异性识别,均可作为诊断抗原。3、诱导表达菌体超声波裂解后,SDS-PAGE显示三种蛋白均为可溶性表达；通过GST层析柱对三种蛋白进行纯化,同时纯化空标签蛋白作为对照。用纯化的表达蛋白和GST分别作为包被抗原包被酶标板,排除GST蛋白的反应性,并比较三种重组蛋白的抗原性,选出抗原性最好的重组蛋白用于建立快速检测猪囊尾蚴病的间接ELISA方法。4、根据筛选结果,用纯化的表达蛋白M13h作为包被抗原包被酶标板,初步建立了快速检测猪囊尾蚴病的间接ELISA方法。抗原包被浓度为1μg·mL-1;抗体稀释度为1：100,37℃作用45min;羊抗猪/人酶标二抗稀释度为1：1000,37℃作用45min;底物溶液室温显色5min;包被后的ELISA板4℃能够保存6个月。经过特异性、敏感性试验进一步表明,建立的间接ELISA方法特异性强、灵敏度高。同时进行了诊断试纸条的标示。为猪囊尾蚴病的诊断与检测提供了一种简便、快捷、价格低廉的技术手段。

全文目录

致谢  4-6
缩略词表  6-9
中文摘要  9-10
文献综述  10-20
试验一猪囊尾蚴三种低分子量抗原基因的克隆及其序列分析  20-31
  1.材料与方法  20-24
  2.结果与分析  24-29
  3.讨论与小结  29-31
试验二猪囊尾蚴三种低分子量抗原在大肠杆菌细胞中的表达、鉴定及纯化  31-40
  1.材料与方法  31-35
  2.结果与分析  35-38
  3.讨论与小结  38-40
试验三猪囊尾蚴三种低分子量抗原免疫反应性的比较  40-45
  1.材料与方法  40-41
  2.结果与分析  41-43
  3.讨论与小结  43-45
试验四猪囊尾蚴排泄分泌抗原M13h重组蛋白抗体检测方法的初步建立  45-51
  1.材料与方法  45-47
  2.结果与分析  47-50
  3.讨论与小结  50-51
结论  51-52
参考文献  52-59
英文摘要  59-61
个人简历  61

亚洲型猪囊尾蚴3个低分子量抗原基因的克隆、表达及ELISA检测方法的建立

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