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APC基因甲基化与人宫颈癌细胞增殖及凋亡相关性研究

作　者: 宋银宏
导　师: 张昌菊
学　校: 三峡大学
专　业: 免疫学
关键词: 宫颈癌 DNA 甲基化 APC 肼苯哒嗪
分类号: R737.33
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


目的:检测人宫颈癌细胞系HeLa(HPV18型)、CaSki和SiHa(HPV16型)中结肠腺瘤性息肉病( adenomatous polyposis coli, APC)基因5’端启动子区CpG岛甲基化状态,探索APC基因表达沉默是否与其启动子区CpG岛甲基化有关,观察肼苯哒嗪(Hydralazine)能否作为去甲基化药物诱导APC基因表达,并进一步探讨肼苯哒嗪对宫颈癌细胞的生长抑制作用,为宫颈癌的诊断及去甲基化治疗提供新的实验依据。方法:(1)利用甲基化特异性PCR(Methylation specific PCR, MSP)检测人宫颈癌细胞系HeLa、CaSki和SiHa中APC基因5’端启动子区CpG岛甲基化状态。(2)不同浓度肼苯哒嗪处理上述三种宫颈癌细胞及正常细胞人脐静脉内皮细胞HECV,MTT法检测各组细胞生长情况。(3)MSP法检测肼苯哒嗪处理后HeLa和CaSki细胞中APC基因5’端启动子区CpG岛甲基化状态;反转录PCR(RT-PCR)及荧光定量PCR(FQ-PCR)法检测肼苯哒嗪对APC mRNA表达的影响;(4)流式细胞术检测肼苯哒嗪对细胞周期和细胞凋亡的影响,免疫组化SP法检测肼苯哒嗪对APC相关蛋白β-连环蛋白(β-catenin,β-cat)表达的影响。结果:(1)MSP检测结果表明HeLa细胞系APC基因5’端启动子区存在CpG岛甲基化,CaSki细胞系APC基因为半甲基化,SiHa细胞系APC基因无甲基化。(2) 5、10、20、40、80、160和320μmol/L肼苯哒嗪分别处理三种宫颈癌细胞系及正常细胞HECV,MTT法检测到20μmol/L以上肼苯哒嗪处理72 h后,三种宫颈癌细胞系的生长均可被抑制,且抑制率随时间及药物浓度的增加而逐渐升高;当40μmol/L肼苯哒嗪处理72 h后,HeLa、CaSki和SiHa细胞系的生长抑制率分别为(52.12±3.78) %、(44.31±2.59) %、(47.73±4.73) %,而同样情况下,正常细胞HECV表现为耐药,抑制率只有(27.18±0.79) %。(3) MSP法检测40μmol/L肼苯哒嗪处理后HeLa和CaSki细胞中APC基因甲基化状况,发现APC基因启动子呈去甲基化状态,RT-PCR检测发现APC mRNA在HeLa和CaSki细胞中均呈阳性表达,FQ-PCR法观察到肼苯哒嗪处理HeLa、CaSki和SiHa三种细胞后,APC mRNA表达分别是处理前的10.35倍、11.40倍及0.73倍。(4)流式细胞仪分析发现:40μmol/L肼苯哒嗪作用HeLa、CaSki细胞72 h后,细胞周期的G0/G1期均显著减少,细胞被阻滞于S期和G2/M期,且凋亡率与对照组比较均显著增多(P<0.01);SP法检测到40μmol/L肼苯哒嗪处理HeLa和CaSki细胞72 h后,β-cat蛋白可恢复在细胞膜上的表达。结论:(1)两种不同HPV型别的HeLa和CaSki细胞中APC基因5’端启动子区均存在CpG岛甲基化,APC基因甲基化在人宫颈癌癌变过程中可能是一种比较重要的分子调控机制。和CaSki同为HPV16型的SiHa细胞中APC基因5’端启动子区无CpG岛甲基化,表明人宫颈癌细胞的HPV型别和APC基因5’端启动子区CpG岛是否甲基化无相关性。(2)肼苯哒嗪能作为去甲基化药物诱导因启动子区CpG岛甲基化而表达沉默或减少的APC基因表达呈阳性或者表达增强。(3)肼苯哒嗪抑制宫颈癌细胞系生长的机制不是单一的使APC基因去甲基化。(4)肼苯哒嗪抑制宫颈癌细胞系生长的主要原因是将细胞阻滞于S期和G2/M期,同时使凋亡增多。(5)肼苯哒嗪处理能阻止Wnt信号转导,相关癌基因不能转录,这可能也是其抑制宫颈癌细胞生长的原因之一。

全文目录


内容摘要  4-6
Abstract  6-9
引言  9-11
1 人宫颈癌细胞系中APC 基因甲基化状况的检测  11-21
  1.1 材料与方法  11-16
  1.2 结果  16-19
  1.3 讨论  19-21
2 肼苯哒嗪抑制人宫颈癌细胞系增殖的研究  21-27
  2.1 材料与方法  21-22
  2.2 结果  22-25
  2.3 讨论  25-27
3 肼苯哒嗪对人宫颈癌细胞系中 APC 基因甲基化状况、APCmRNA 和β-cat 蛋白表达的影响研究  27-38
  3.1 材料与方法  27-31
  3.2 结果  31-36
  3.3 讨论  36-38
4 肼苯哒嗪对人宫颈癌细胞系细胞周期及凋亡的影响研究  38-43
  4.1 材料与方法  38
  4.2 结果  38-42
  4.3 讨论  42-43
5 结论  43-44
参考文献  44-47
综述  47-53
缩略词表  53-54
后记  54-55
附录  55

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 泌尿生殖器肿瘤 > 女性生殖器肿瘤 > 子宫肿瘤
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