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重组克痛宁在巴斯德毕赤酵母中的表达

作　者: 张伟
导　师: 陈劲春
学　校: 北京化工大学
专　业: 生物化工
关键词: 克痛宁巴斯德毕赤酵母基因工程菌诱导表达
分类号: TQ464
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

克痛宁(α-Cobratoxin)是一种来源于眼镜王蛇毒腺的神经毒素,含72个氨基酸残基,空间结构为三指环形,具有与神经肌肉接头的N-型乙酰胆碱受体(nAChR)结合的活性;常用来作为研究AChR结构、功能及其相互关系,以及研究神经传导和离子通道等的工具。同时克痛宁也具有较高的医用价值,如治疗重症肌无力,并且有良好的镇痛、戒毒和抑瘤作用等。但由于眼镜王蛇属于国家二级保护动物,采用杀蛇取毒的方法药源受到限制,不能满足市场需求,因此我们采用基因工程的方法来生产克痛宁。本研究选用了巴斯德毕赤酵母作为基因表达系统,受体菌为GS115菌株,分泌型质粒pPIC9为载体,构建重组质粒pPIC9k/HIP,线性化后,电击法转化巴斯德毕赤酵母,筛选出his~+Mut~s表型阳性克隆菌株GS115-CBT 18株。在此基础上,进一步利用重组菌对G418抗性的差异筛选出了具有不同外源基因拷贝数的菌株,并成功表达了克痛宁前体。小试样品经分离纯化后获得了少量克痛宁前体样品,肠激酶酶切后用Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳进行分子量分析,结果表明所设计的克痛宁基因在毕赤酵母中获得了正确的表达。为了适应工业化生产,本文还对菌种生长及诱导表达条件进行了探索优化。针对发酵过程中对产量影响较大的因素进行了正交实验分析,得出了最佳培养条件:pH值6.0,微量元素为7.5mL/L,硫酸铵浓

全文目录

第一章文献综述  12-29
  1．1 克痛宁(蛇神经毒素)简介  12-21
    1．1．1 蛇神经毒素的分类  13-14
    1．1．2 蛇神经毒素的分子结构  14-16
    1．1．3 蛇神经毒素的受体  16-17
    1．1．4 蛇神经毒素作用的分子机制  17-18
    1．1．5 蛇神经毒素在理论研究中的应用  18
    1．1．6 蛇神经毒素的临床应用  18-19
    1．1．7 研究现状及发展趋势  19
    1．1．8 蛇毒α-神经毒素及其基因研究进展  19-21
      1．1．8．1 α-NT蛋白质结构  19-20
      1．1．8．2 α-NT的cDNA  20
      1．1．8．3 α-NT的基因组DNA  20-21
      1．1．8．4 α-NT的人工合成与表达  21
  1．2 酵母表达系统  21-28
    1．2．1 异源蛋白在酵母菌中表达的一般步骤  21-22
    1．2．2 巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展  22-28
      1．2．2．1 巴斯德毕赤酵母表达系统简介  22-23
      1．2．2．2 表达载体的发展  23-24
      1．2．2．3 受体菌的发展  24-25
      1．2．2．4 外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中高效表达的策略  25-27
      1．2．2．5 总结和展望  27-28
  1．3 论文的新颖性  28-29
第二章克痛宁(CBT)重组菌株的构建及筛选  29-36
  2．1 设计思路及研究方案  29-30
    2．1．1 基因序列的设计  29
    2．1．2 研究方案  29-30
  2．2 实验材料与方法  30-36
    2．2．1 实验材料  30-31
      2．2．1．1 菌种和质粒  30
      2．2．1．2 其它材料  30
      2．2．1．3 仪器设备  30-31
    2．2．2 试验方法  31-33
      2．2．2．1 pPIC9K／Bi质粒的提取  31-32
      2．2．2．2 pPIC9K／Bi质粒线性化  32
      2．2．2．3 pPIC9K／Bi质粒浓度与纯度的测定  32
      2．2．2．4 pPIC9K／Bi质粒的检验  32
      2．2．2．5 制备GS115感受态  32-33
      2．2．2．6 电转化  33
      2．2．2．7 筛选his~+Mut~s阳性克隆  33
      2．2．2．8 G418筛选高拷贝转化子  33
    2．2．3 结果与讨论  33-36
      2．2．3．1 提取pPIC9K／Bi质粒浓度与纯度测定  33-34
      2．2．3．2 对pPIC9K／Bi质粒进行DNA测序  34
      2．2．3．3 电转化及其条件的优化  34
      2．2．3．4 His~+Mut~s转化子与高拷贝转化子的筛选  34-36
第三章目标蛋白的诱导表达与分析  36-40
  3．1 研究目的  36
  3．2 试验材料  36-37
    3．2．1 试剂  36
    3．2．2 仪器设备  36-37
  3．3 试验方法  37-39
    3．3．1 克痛宁(CBT)在高拷贝数菌株中的诱导表达  37
    3．3．2 Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳  37-39
      3．3．2．1 Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳缓冲液体系  37
      3．3．2．2 Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳垂直板凝胶的制备  37-38
      3．3．2．3 蛋白样品的制备  38
      3．3．2．4 蛋白样品的凝胶电泳  38
      3．3．2．5 电泳后凝胶的固定及染色  38-39
  3．4 结果与讨论  39
  3．5 本章小结  39-40
第四章发酵培养条件的优化  40-49
  4．1 研究目的  40
  4．2 试验材料  40-41
    4．2．1 菌种  40
    4．2．2 试剂  40
    4．2．3 仪器设备  40-41
  4．3 试验操作及方法  41-43
    4．3．1 基础盐培养基发酵  41
    4．3．2 细胞干湿重与OD_(600)值关系的测定  41
    4．3．3 发酵液中中甘油浓度的测定  41-42
      4．3．3．1测定原理  41-42
      4．3．3．2 测定方法  42
    4．3．4 发酵液中总蛋白浓度的测定  42-43
      4．3．4．1 原理  42
      4．3．4．2 各种母液的配制  42-43
      4．3．4．3 标准曲线的测定  43
      4．3．4．4 发酵液样品蛋白浓度的测定  43
    4．3．5 发酵条件的优化  43
    4．3．6 克痛宁(CBT)的小试发酵  43
  4．4 结果与讨论  43-48
    4．4．1 细胞干湿重与OD_(600)值的关系  43-44
    4．4．2 发酵条件的优化  44-47
      4．4．2．1诱导期pH值的优化  44-45
      4．4．2．2 溶氧条件的优化  45-46
      4．4．2．3 补加油酸策略的优化  46
      4．4．2．4培养基组分的优化  46-47
    4．4．3 克痛宁的小试放大  47-48
  4．5 本章小结  48-49
第五章克痛宁的初步分离纯化及活性鉴定  49-53
  5．1 研究目的  49
  5．2 材料与仪器  49
  5．3 实验方法  49-51
    5．3．1 样品预处理  49-50
    5．3．2 去除杂蛋白  50
    5．3．3 离子交换吸附  50-51
  5．5 活性鉴定  51-52
    5．5．1 目标蛋白前体的酶切  51-52
    5．5．2 动物实验验证  52
  5．6 本章小结  52-53
第六章结论  53-54
第七章问题与建议  54-55
参考文献  55-60
附录一培养基  60-62
附录二缓冲液  62-65
附录三：离子交换柱特征表  65-71
致谢  71-72
攻读学位期间发表的学术论文  72

重组克痛宁在巴斯德毕赤酵母中的表达

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