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猪乳铁蛋白工程菌发酵技术参数研究

作　者: 汪敏
导　师: 汪以真
学　校: 浙江大学
专　业: 动物营养与饲料科学
关键词: 猪乳铁蛋白 基因工程菌 发酵 优化 工艺参数 抑菌试验
分类号: S816.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


乳铁蛋白是一种广泛存在于哺乳动物外分泌液中的多功能糖蛋白,它具有杀菌、抗病毒、抗氧化、抗癌、调节免疫系统等多种生物学功能。本文研究内容是在本课题组前期成功完成猪乳铁蛋白基因在毕赤嗜甲醇酵母表达系统中构建的基础上,结合现代微生物发酵技术,对所构建重组菌株的发酵工艺和发酵表达产物作用效果进行了研究。取得的主要结果如下：1.试验研究了重组猪乳铁蛋白菌株在种子培养基中的生长代谢规律。在发酵培养的20h内经历了延迟期、对数生长期、减速期和静止期,试验将重组菌株的对数生长期中期时间(13h)确定为最佳接种种龄时间并用于后期试验。试验研究了重组菌株在甲醇诱导作用下,目的蛋白在168h内的表达量的变化规律。目的蛋白表达量随诱导发酵时间的延长呈现先增加后降低的趋势,诱导发酵144h后达到表达量最高点,试验将144h设定为效价分析检测点和诱导发酵周期。2.在摇瓶发酵环境中通过单因素试验设计：改变发酵基础培养基中一种营养成分的种类或用量,其它营养成分种类和用量不变。通过单因素试验筛选出了最佳的碳源、氮源、碳源添加量、C/N。在单因素试验的基础上,试验设计了L16(45)正交优化试验,通过摇瓶发酵培养筛选出了最适重组菌株蛋白表达的发酵培养基。此外,试验还对影响重组菌株蛋白表达的相关因素(初始pH值、接种量)进行了选择性优化,确定了摇瓶发酵培养条件。摇瓶发酵的最适合培养基及其添加量：最佳碳源马铃薯淀粉(40g/L)、最佳氮源豆粕(8g/L)、生物素4mL/L(4×10-5％)、MgS04.7H20添加量为5g/L和KH2P04添加量3g/L。在250ml三角瓶中装入50ml培养基,发酵温度为30℃、摇床转速为250 r.min-1的条件下,发酵初始pH值为4.5、发酵后期pH值为5.0,种子培养液的接种量为4%的条件下,对摇瓶发酵环境中目的蛋白表达最为适宜。在此发酵条件下经反相高效液相色谱检测,重组菌株目的蛋白表达量达55.5μg/mL(检测样品经1/4倍体积浓缩)。3.在摇瓶发酵研究的基础上,试验利用10L发酵罐对重组菌株进行分批发酵培养。通过摇瓶发酵试验筛选得出的培养基,在初步的发酵罐放大试验中得到应用,试验菌株可以稳定地利用其进行生长和产物表达。试验利用10L发酵罐研究了影响重组菌株生长和目的蛋白表达的发酵工艺参数,通过分批发酵,选择性地研究了机械搅拌转速、初始pH值和温度,对发酵过程中重组菌株菌体生长和目的蛋白表达的影响,试验研究确定了重组菌株在10L发酵罐中的相关发酵工艺参数。试验研究了不同的甲醇添加方式对试验菌株生长和目的蛋白表达量的影响,确定了最佳的补料方式。试验菌株在10L发酵罐中最佳发酵参数：机械搅拌转速为300-350 r.min-1,采用分段控制策略；发酵初始pH值为4.8；发酵温度为28-30℃,采用分段控制策略；通气比为1.0vvm。发酵24h后,每12h向发酵罐中补充一定浓度的甲醇用于试验菌株目的蛋白诱导。在发酵工艺参数优化后的10L发酵罐中,经检测重组菌株目的蛋白表达量达604.4μg/mL(检测样品经1/4倍体积浓缩)。4.通过薄层琼脂糖孔穴扩散试验和时间动态曲线试验对重组菌株发酵表达产物抗菌效果进行研究。薄层琼脂糖孔穴扩散试验结果直观的显示了,重组发酵产物对大肠杆菌E.coli K88的生长有显著的抑制作用,且抑制作用效果与重组目的蛋白试验量存在直接的关系。时间动态曲线试验进一步从动态的角度证实,重组菌株诱导表达产物对猪霍乱沙门氏菌和鼠伤害沙门氏菌的生长均具有抑制、杀灭作用。本文研究内容是以产业化应用为立足点,在摇瓶发酵环境中筛选出适合工业化发酵生产使用的培养基配方,在10L发酵罐放大应用研究试验中可以被有效的用于重组菌株的生长代谢和目的蛋白的表达。通过10L发酵罐的放大应用试验以及相关发酵工艺参数的研究,可以为重组乳铁蛋白菌株的发酵应用研究提供所需的技术参数。此外,重组菌株发酵表达产物的抑菌作用研究,可以为发酵乳铁蛋白替代抗生素的产业化研究提供相关的依据。

全文目录


致谢  4-9
摘要  9-11
Abstract  11-13
前言  13-14
第一部分 乳铁蛋白相关研究进展  14-27
  第一节 乳铁蛋白(LF)研究  14-20
    1.乳铁蛋白(LF)及其活性多肽结构  14
    2.乳铁蛋白的生物学功能和作用机理  14-19
      2.1 促进肠道细胞对铁离子的吸收  14-15
      2.2 抗菌作用  15-16
        2.2.1 抑菌作用  15
        2.2.2 杀菌作用  15-16
      2.3 抗病毒作用  16-17
      2.4 抗氧化作用  17
      2.5 调节机体免疫功能  17-18
      2.6 抗感染作用  18-19
      2.7 其它的相关作用  19
    3.研究LF结构的意义  19
    4.乳铁蛋白及其小肽的国内外研究动态  19-20
  第二节 乳铁蛋白(LF)基因重组表达研究  20-21
  第三节 PICHIA METHANOLICA甲醇营养型酵母表达系统  21-26
    1.P.methanolica系统的特点  21-22
    2.P.methanolica的甲醇代谢机理  22
    3.P.methanolica系统的表达宿主菌  22-23
    4.P.methanolica的表达载体  23
    5.表达载体与宿主菌的转化与整合  23-24
    6.蛋白翻译后加工  24
    7.利用P.methanolica系统表达外源基因的一般步骤  24-25
    8.P.methanolica酵母的蛋白质分拣和区域化  25
    9.P.methanolica表达系统的特点和应用前景  25-26
  第四节 本文的研究目的和意义  26-27
第二部分 研究内容  27-62
  第一章 重组乳铁蛋白菌株摇瓶发酵条件研究  27-45
    1.试验材料  27-28
      1.1 试验出发菌株  27
      1.2 培养基  27
        1.2.1 YPD固体培养基  27
        1.2.2 种子培养基  27
        1.2.3 发酵基础培养基  27
      1.3 主要试剂和仪器  27-28
        1.3.1 培养基中使用的主要试剂  27
        1.3.2 主要仪器  27-28
    2.试验方法与设计  28-30
      2.1 发酵培养方法  28
        2.1.1 种子活化方法  28
        2.1.2 摇瓶种子培养  28
        2.1.3 重组菌株发酵研究  28
      2.2 效价测定  28
        2.2.1 菌体浓度测定  28
        2.2.2 目的蛋白表达量SDS-PAGE分析  28
      2.3 发酵原料处理  28-29
        2.3.1 发酵碳源酸法水解处理  28-29
        2.3.2 发酵氮源酸法水解处理  29
      2.4 摇瓶发酵试验设计  29-30
        2.4.1 接种种龄及诱导表达时间确定  29
        2.4.2 单因素优化试验  29
        2.4.3 培养基正交优化试验  29-30
        2.4.4 初始pH对菌体生长和目的蛋白表达量的影响  30
        2.4.5 接种量对菌体生长和目的蛋白表达量的影响  30
        2.4.6 摇瓶最佳发酵条件下目的蛋白定量检测  30
    3.结果与讨论  30-43
      3.1 接种种龄确定  30-31
      3.2 重组菌株诱导表达时间关系  31-32
      3.3 发酵培养基单因素优化试验  32-38
        3.3.1 不同碳源对重组菌体生长和目的蛋白表达量的影响  32-34
        3.3.2 不同氮源对重组菌体生长和目的蛋白表达量的影响  34-35
        3.3.3 不同浓度马铃薯淀粉对菌体生长和目的蛋白表达的影响  35-36
        3.3.4 不同C/N对菌体生长和目的蛋白表达的影响  36-38
      3.4 正交优化试验对菌体生长和目的蛋白表达的影响  38-40
      3.5 不同初始pH对菌体生长和目的蛋白表达的影响  40-41
      3.6 不同接种量对菌体生长和目的蛋白表达的影响  41-42
      3.7 摇瓶最佳发酵条件下目的蛋白定量检测  42-43
    4.结论  43-45
  第二章 重组乳铁蛋白菌株10L罐发酵工艺研究  45-57
    1.试验材料  45-46
      1.1 试验出发菌株  45
      1.2 培养基  45
        1.2.1 YPD固体培养基  45
        1.2.2 种子培养基  45
        1.2.3 发酵基础培养基  45
      1.3 主要试剂和仪器  45-46
    2.实验方法  46-48
      2.1 发酵培养方法  46
        2.1.1 种子活化方法  46
        2.1.2 摇瓶种子培养  46
        2.1.3 10L罐发酵基础条件  46
      2.2 效价测定  46
        2.2.1 菌体浓度测定  46
        2.2.2 目的蛋白表达量SDS-PAGE分析  46
        2.2.3 发酵液pH、DO(溶氧)测定  46
      2.3 马铃薯淀粉双酶法水解  46-47
      2.4 单一条件控制试验  47
      2.5 分阶段控制和补料试验  47
      2.6 发酵罐最佳发酵条件下目的蛋白定量检测  47-48
    3.结果与讨论  48-56
      3.1 分批发酵条件研究  48-53
        3.1.1 不同转速对重组菌体生长和目的蛋白表达的影响  48-50
        3.1.2 不同初始pH对重组菌体生长和目的蛋白表达的影响  50-51
        3.1.3 不同温度对重组菌体生长和目的蛋白表达的影响  51-53
      3.2 分阶段控制发酵条件研究  53-54
        3.2.1 搅拌转速的分阶段控制  53-54
        3.2.2 分批补料培养对菌体生长和目的蛋白表达量的影响  54
      3.3 10L发酵罐最佳发酵条件下目的蛋白定量检测  54-56
    4.结论  56-57
  第三章 10L罐发酵重组表达产物抑菌效果研究  57-62
    1.材料与方法  57-58
      1.1 试验材料  57-58
        1.1.1 试验菌株  57
        1.1.2 抑菌材料  57
        1.1.3 培养基  57-58
      1.2 试验方法  58
        1.2.1 发酵产物  58
        1.2.2 薄层琼脂糖孔穴扩散法  58
        1.2.3 时间动态曲线法  58
    2.结果与讨论  58-62
小结  62
创新点  62-63
参考文献  63-70

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 普通畜牧学 > 饲料 > 饲料添加剂
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