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3-苯氧基苯甲酸降解菌Sphingobium sp. BA3的分离鉴定、生物学特性及基因工程菌的构建

作　者: 段晓芹
导　师: 何健
学　校: 南京农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 3-苯氧基苯甲酸 生物降解 鞘脂菌 菊酯水解酶基因 基因工程菌
分类号: X172
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 13次
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内容摘要


从石油污染土壤中分离到1株能以3-苯氧基苯甲酸(3-PBA)为唯一碳源生长的细菌BA3 (GenBank Accession No.GQ176409)。据其生理生化特征和16S rRNA基因序列序列相似性分析,将该菌鉴定为鞘脂菌属(Sphingobium sp.)。对BA3的生物学特性研究结果显示,该菌株在pH5.0-8.0范围内生长良好,在pH7.0生长最好,最适生长温度为30℃,装液量20mL时,生长量最大,随着装液量的增加生长呈下降趋势。在5-15mg·L-1的盐浓度范围生长较好,以葡萄糖为碳源,以有机氮为氮源的培养基中生长较好,对链霉素有抗性。该菌株在60h内对100mg L-1的3-苯氧基苯甲酸降解率达到99%。降解3-苯氧基苯甲酸的最适温度为30℃,pH值为7.0,降解速率与初始接种量呈正相关。接种量大于3%时有较高降解效果。通过降解菌株BA3利用化合物的情况,发现能利用邻苯二酚、原儿茶酸、对苯二酚、和间苯二酚等,但不能利用苯酚、对硝基苯酚和2,4-二硝基苯酚。根据下载的1,2-双加氧酶基因的保守区设计引物,从3-PBA降解菌株BA3扩增到邻苯二酚1,2-加氧酶基因,得到400bp大小的片段,通过比对发现该序列与Sphingobium sp.YBL3和Sphingobium sp.YBL2的catA基因同源性最高,达到84%。拟除虫菊酯类杀虫剂pytH水解酶基因为研究发现的一个新的菊酯水解酶基因,过PCR从菊酯降解菌株JZ-2总DNA扩增了pytH,将pytH定向克隆到pBBRMCS-5载体上,构建重组质粒pPYTH,在辅助质粒pRK600的帮助下,三亲接合将pPYTH转移到3-PBA降解菌株Sphingobium sp.BA3中,得的工程菌Sphingobium sp.BA3-pytH可以快速降解菊酯类杀虫剂及其中间产物3-PBA; BA3-pytH对菊酯的降解效率较出发菌株JZ-2高。该基因工程菌应比野生菌株JZ-2在菊酯污染环境的生物修中具有优势。

全文目录


摘要  7-8ABSTRACT  8-10符号与缩略语说明  10-11前言  11-13文献综述  13-29  1 拟除虫菊酯杀虫剂的应用及其污染  13  2 拟除虫菊酯类农药的微生物降解  13-15  3 农药降解基因工程菌的研究进展  15-19    3.1 基因工程菌构建的方法  15-17    3.2 基因工程菌的构建载体  17-18    3.3 基因工程菌构建研究中存在的问题  18-19    3.4 农药降解基因工程菌的生物修复应用  19  4 二苯醚醛键的物质对生态环境和人类健康的的危害  19-20  5 二苯醚醛键的物质的微生物降解  20-21  6 3-苯氧基苯甲酸性质及其应用  21-23  参考文献  23-29第一章 3-苯氧基苯甲酸降解菌BA3的分离与鉴定  29-41  1 材料与方法  29-32    1.1 菌株、培养基与试剂  29-30    1.2 降解菌株的富集与分离  30    1.3 降解菌株的培养特征及生理生化鉴定  30    1.4 降解菌株的16S rRNA基因序列的测定  30-32    1.5 降解菌株系统发育地位的确定  32    1.6 3-PBA含量的测定  32    1.7 菌体生长量的测定  32  2 结果与分析  32-37    2.1 污染土壤中3-PBA降解菌株的分离  32-33    2.2 降解菌株BA3的菌落形态及生理生化特征  33    2.3 降解菌株BA3的鉴定结果  33-35    2.4 境条件对降解菌株BA3生长的影响  35-37    2.5 降解菌株BA3对抗生素的耐受性  37  3 本章小结  37-38  参考文献  38-41第二章 3-苯氧基苯甲酸降解菌BA3降解特性研究  41-51  1 材料与方法  41-42    1.1 培养基与试剂  41    1.2 菌体生长量的测定  41    1.3 菌株BA3对3-苯氧基苯甲酸农药降解特性研究  41-42    1.4 底物利用试验  42    1.5 菌株中的catA基因的扩增  42  2 结果与分析  42-48    2.1 菌株以3-PBA为唯一碳源的生长及降解实验  42-44    2.2 化合物起始浓度对菌株BA3降解3-PBA的影响  44    2.3 接种量对BA3降解3-PBA的影响  44-45    2.4 pH值对菌株BA3降解3-PBA的影响  45    2.5 度对BA3降解3-PBA的影响  45-46    2.6 底物利用谱  46    2.7 catA基因的扩增  46-48  3 本章小结  48-49  参考文献  49-51第三章 拟除虫菊酯类杀虫剂基因工程菌的构建  51-59  1 材料与方法  51-53    1.1 菌株与质粒  51-52    1.2 培养基及培养条件  52    1.3 抗生素及使用浓度  52    1.4 试剂和酶  52    1.5 DNA的分子操作  52    1.6 菊酯水解酶基因pytH克隆和广宿主载体的构建  52    1.7 基因工程菌的构建  52-53  2 结果与分析  53-56    2.1 pytH基因克隆和表达质粒的构建  53-55    2.2 工程菌的构建  55    2.3 工程菌BA3-pytH对甲氰菊酯的降解  55-56  3 本章小结  56-57  参考文献  57-59全文总结  59-61本文的创新点  61-63附录一 文中所用培养基及试剂配方  63-65附录二 相关DNA序列  65-67攻读硕士学位期间发表或已接收的学术论文  67-69致谢  69

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中图分类: > 环境科学、安全科学 > 环境科学基础理论 > 环境生物学 > 环境微生物学
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