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腈水合酶在大肠杆菌中的表达与纯化

作　者: 周全伟
导　师: 王筱兰
学　校: 江西师范大学
专　业: 生物化工
关键词: 诺卡氏菌 腈水合酶 重组质粒 诱导表达
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


微生物产生的腈水合酶是催化丙烯腈生成丙烯酰胺的重要生物催化剂。它的反应条件温和、产率高、副产物少、产物的自聚率低、具有区域和立体选择性,可广泛地应用于氨基酸、酰胺、羧酸及其衍生物的合成。本文通过PCR扩增得到诺卡氏菌的腈水合酶基因。先是构建了BL21-pGEX-4T-1/NHase重组菌,表达GST-NHase融合蛋白。但是由于GST的相对分子质量较大,阻碍了腈水合酶的β亚基与α亚基的正确结合,从而使腈水合酶表现不出酶活。利用凝血酶对纯化后的GST-NHase融合蛋白进行酶切,酶切产物先后经GlutathioneSepharose 4B亲和柱和苯甲脒柱结合分别去除酶切下的GST蛋白和凝血酶,得到较纯的腈水合酶,气相色谱检测比酶活为100U/mg。之后,又构建了BL21-pET-30c/NHase重组菌,IPTG诱导表达结果显示,腈水合酶α亚基基本上没有得到表达,影响了腈水合酶的活性。生物信息学分析发现腈水合酶α亚基的起始密码子为gtg,可能不易被大肠杆菌的RNA聚合酶识别,于是通过点突变将gtg替换成atg,阳性重组子经IPTG诱导表达结果显示腈水合酶β亚基和α亚基的表达量都有所提高,气相色谱法检测腈水合酶的活性也有所提高,比酶活达到了200U/mg。诱导表达的菌液经超声破碎后,离心得到的粗酶液,再用EPI-30-ARG-IDA-Co2+亲和载体纯化带6×His tag的腈水合酶。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-8
第一章 绪论  8-22
  1.1 腈水合酶的研究进展  8-11
    1.1.1 腈水合酶的产生菌及其结构  8-9
    1.1.2 腈水合酶基因序列的特性  9
    1.1.3 腈水合酶以基因簇的形式存在  9-11
    1.1.4 腈水合酶基因序列  11
  1.2 丙烯酰胺的概述  11-14
    1.2.1 丙烯酰胺的性质  11
    1.2.2 丙烯酸胺的用途  11-13
      1.2.2.1 石油工业中的应用  12
      1.2.2.2 水处理的应用  12-13
      1.2.2.3 造纸工业中的应用  13
      1.2.2.4 采矿、冶金、洗煤工业中的应用  13
    1.2.3 丙烯酰胺的市场预期  13-14
  1.3 生物法生产丙烯酰胺的发展历史  14-15
    1.3.1 硫酸水合法  15
    1.3.2 铜催化水合法  15
    1.3.3 微生物转化法  15
  1.4 高活性腈水合酶菌株的筛选方法  15-18
    1.4.1 微波诱变育种  16-17
    1.4.2 基因组重排育种  17-18
  1.5 腈水合酶基因克隆的研究进展  18-19
    1.5.1 克隆腈水合酶基因的常用方法  18
    1.5.2 腈水合酶重组蛋白诱导表达的研究进展  18-19
  1.6 本研究的目的和意义  19-20
  1.7 腈水合酶基因研究的发展方向  20-22
第二章 诺卡氏菌腈水合酶基因的克隆及表达载体的构建  22-31
  2.1 引言  22
  2.2 实验材料  22-24
    2.2.1 菌株、质粒  22
    2.2.2 试剂  22-23
    2.2.3 培养基  23
    2.2.4 化学药品  23-24
  2.3 仪器与设备  24-25
  2.4 实验方法  25-28
    2.4.1 诺卡氏菌总DNA 的提取  25
    2.4.2 PCR 扩增腈水合酶基因  25-26
    2.4.3 重组质粒pMD-18T-NHase 的构建  26-28
      2.4.3.1 PCR 产物的回收纯化  26-27
      2.4.3.2 载体连接  27
      2.4.3.3 大肠杆菌的生长、维持和保藏  27
      2.4.3.4 CaCI_2 法制备大肠杆菌DH-5α感受态细胞  27
      2.4.3.5 大肠杆菌重組质粒pMD-18T-NHase 的分离  27-28
      2.4.3.6 重組质粒pMD-18T-NHase 的鉴定  28
  2.5 实验结果  28-30
    2.5.1 腈水合酶基因的克隆  28-29
    2.5.2 重組质粒pMD-18T-NHase 的鉴定  29-30
    2.5.3 重组质粒pGEX-4T-1/NHase 的双酶切鉴定  30
  2.6 讨论与小结  30-31
第三章 GST-NHase 融合蛋白的诱导表达、纯化及鉴定  31-39
  3.1 引言  31
  3.2 材料  31-32
    3.2.1 药品与试剂  31-32
      3.2.1.1 GST 酶活反应试剂  31-32
      3.2.1.2 蛋白纯化试剂  32
    3.2.2 主要仪器  32
  3.3 方法  32-34
    3.3.1 GST-NHase 融合蛋白的诱导表达  32
    3.3.2 GST-NHase 融合蛋白的诱导条件的优化  32
    3.3.3 GST-NHase 融合蛋白的分离纯化  32-33
    3.3.4 GST-NHase 融合蛋白的SDS-PAGE 鉴定  33
    3.3.5 GST 酶活测定  33
    3.3.6 GST-NHase 融合蛋白的酶切  33
    3.3.7 切割后目的蛋白的SDS-PAGE 鉴定  33
    3.3.8 腈水合酶酶活的检测  33-34
  3.4 结果  34-37
    3.4.1 GST-NHase 融合蛋白的诱导条件的优化  34-35
    3.4.2 GST-NHase 融合蛋白的分离纯化  35-36
    3.4.3 GST-NHase 融合蛋白的分离纯化及酶切后的SDS-PAGE 鉴定  36-37
  3.5 小结  37-39
第四章 腈水合酶pET-30c 表达体系的构建  39-46
  4.1 引言  39
  4.2 材料  39-40
    4.2.1 主要药品与试剂  39-40
      4.2.1.1 主要药品  39
      4.2.1.2 主要试剂  39-40
    4.2.2 主要仪器  40
  4.3 方法  40-44
    4.3.1 PCR 扩增腈水合酶基因  40-41
    4.3.2 琼脂糖凝胶电泳  41
    4.3.3 重组质粒 pET-30C-NHase 的构建  41-43
      4.3.3.1 PCR 产物的回收纯化  41-42
      4.3.3.2 载体连接  42
      4.3.3.3 质粒及目的基因的Hind III 和NdeⅠ双酶切  42
      4.3.3.4 CaC12 法制备大肠杆菌DH5α/BL21 感受态细胞  42-43
      4.3.3.5 连接液的转化  43
      4.3.3.6 大肠杆菌重組质粒pET-30c-NHase 的分离:  43
      4.3.3.7 重組质粒pET-30c-NHase 及点突变重组质粒pET-30c-NHase 1的鉴定  43
    4.3.4 重组质粒的序列测定  43-44
  4.4 结果  44-45
    4.4.1 以Nde I/Hind III 为酶切位点的窿腈水合酶基因的克隆  44
    4.4.2 重组质粒pMD-18T/pMD-18T/NHase的鉴定及引物NHase3/NHase,NHase4/NHase5 的PCR 产物  44-45
    4.4.3 重组质粒pMD-18T/NHase I,pet-30c/NHase和pet-30c/NHase I的鉴定  45
  4.5 小结  45-46
第五章 His-NHase 的诱导表达与纯化  46-54
  5.1 引言  46
  5.2 材料  46-47
    5.2.1 菌种  46
    5.2.2 试剂  46-47
      5.2.2.1 细菌培养用试剂  46
      5.2.2.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)相关溶液  46-47
      5.2.2.3 蛋白纯化用试剂的配置方法如下  47
    5.2.3 主要实验仪器  47
  5.3 实验方法  47-50
    5.3.1 His-NHase 重组菌的表达  47
    5.3.2 重组菌BL21-pET-30c  47-48
      5.3.2.1 IPTG 浓度的优化  48
      5.3.2.2 His-NHase 及His-NHase I 诱导温度及时间的优化  48
    5.3.3 金属螯合载体EPI-30-ARG-IDA-C02+的制备  48-49
    5.3.4 His-NHase I 融合蛋白的分离纯化  49
    5.3.5 His-NHase 的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳  49
    5.3.6 腈水合酶酶活的检测  49-50
  5.4 结果与讨论  50-53
    5.4.1 重组菌BL21-pET-30c/NHase诱导温度和IPTG的最佳诱导浓度的确定  50-51
    5.4.2 点突变重组菌BL21-pET-30c/NHase诱导温度和IPTG的最佳诱导浓度的确定  51-52
    5.4.3 点突变重组菌BL21-pET-30c/NHase I 表达产物的分离纯化  52-53
  5.5 结论  53-54
参考文献  54-58
致谢  58

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 酶制剂（酵素）
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