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大肠杆菌色氨酸高产菌株的构建

作　者: 左祖桢
导　师: 施碧红
学　校: 福建师范大学
专　业: 微生物学
关键词: L-色氨酸 NTG诱变 TrpEDCBA基因 透明颤菌血红蛋白 低氧诱导表达
分类号: TQ922.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


色氨酸(tryptophan, Trp)是一种重要的营养必需氨基酸,只能由微生物或植物合成。L-色氨酸是8种必须氨基酸之一,人和动物只能从食物中摄取。本实验采用诱变育种及基因克隆手段对一株大肠杆菌进行改造,以望获得能进行大规模工业化生产的L-色氨酸高产菌株。以大肠杆菌(Escherichia coli)MD-T109为出发菌株,经NTG诱变处理,筛选得到7株酪氨酸营养缺陷型突变株。经摇瓶发酵产酸检测,其中1株产酸比出发菌株降低,4株产酸与出发株相当,只有两株L-色氨酸产量较出发菌株得到提高,其中MD-T109-06突变株产酸量较出发菌提高了11.23%,生长速率未受到影响,且遗传稳定性良好。进一步对MD-T109-06突变株进行改造。PCR扩增其trpEDCBA基因并克隆到含tac启动子的pMD-T109表达载体中,电转导入宿主得到工程菌MD-trp-06。经摇瓶发酵产酸检测,其L-色氨酸产量从0.206g／dL提高到0.238g／dL,提高15.5%。工程菌邻氨基苯甲酸合成酶活性提高140%，色氨酸合成酶活性提高166%。为解决高密度发酵过程中通常存在的溶氧限制问题,将透明颤菌血红蛋白基因(vgb)引入工程菌MD-trp-06中。根据Genbank公布的vgb基因及其低氧诱导启动子的序列信息,并按照大肠杆菌偏好密码子进行修饰,人工合成修饰后的vgb片段,通过酶切连接将其克隆到表达质粒pMD-trp,电转化导入MD-trp-06,获得工程菌MD-trp。经低氧诱导vgb基因的表达,摇瓶发酵验证,在250 ml三角瓶中60ml及100ml装液量条件下,检测到vgb基因的表达工程菌相比出发菌株菌浓分别提高了21%和16%,色氨酸产量则提高了16.4%和21%。SDS-PAGE检测到VHb蛋白条带的表达。

全文目录


摘要  2-3
Abstract  3-5
中文文摘  5-8
目录  8-11
绪论  11-23
  1 色氨酸理化性质  11
  2 色氨酸应用  11-12
    2.1 医学应用  11-12
    2.2 食品工业应用  12
    2.3 饲料添加剂  12
  3 色氨酸生产方法  12-14
    3.1 蛋白质水解及化学合成法  12-13
    3.2 酶法  13
    3.3 微生物前体转化法  13-14
    3.4 直接发酵法  14
  4 代谢工程在色氨酸生产菌株构建中的应用  14-16
  5 色氨酸合成途径及代谢调控机制  16-17
  6 高密度发酵及透明颤菌血红蛋白的应用  17-18
  7 透明颤菌血红蛋白及其研究应用进展  18-21
    7.1 透明颤菌血红蛋白简介  18-19
    7.2 VHb的结构与特性  19-20
    7.3 VHb的作用机制  20-21
  8 本课题研究内容及意义  21-23
    8.1 本课题研究目的和意义  21-22
    8.2 本课题研究内容  22-23
第一章 L-色氨酸高产菌株的选育  23-33
  1.1 前言  23
  1.2 实验材料  23-25
    1.2.1 菌种  23-24
    1.2.2 主要仪器  24
    1.2.3 培养基  24-25
    1.2.4 相关溶液  25
  1.3 实验方法  25-27
    1.3.1 诱变处理  25
    1.3.2 中间培养  25
    1.3.3 淘汰野生型(青霉素法)  25-26
    1.3.4 营养缺陷型的检出  26
    1.3.5 缺陷型菌株摇瓶发酵  26
    1.3.6 色氨酸含量测定  26-27
  1.4 结果与分析  27-30
    1.4.1 致死率计算  27-28
    1.4.2 酪氨酸营养缺陷型菌株的筛选  28
    1.4.3 色氨酸标准曲线的绘制  28-30
  1.5 小结  30-33
第2章 TrpE-A基因的克隆表达  33-45
  2.1 前言  33
  2.2 实验材料  33
  2.3 实验方法  33-39
    2.3.1 大肠杆菌总DNA的提取  33-34
    2.3.2 质粒DNA的小量制备  34
    2.3.3 引物设计与合成  34-35
    2.3.4 PCR扩增TrpEDCBA基因  35
    2.3.5 TrpEDCBA基因片段回收  35-36
    2.3.6 TrpEDCBA片段与pMD-T109质粒的酶切连接  36-37
    2.3.7 工程质粒的电击转化  37
    2.3.8 转化菌株的验证  37-38
    2.3.9 阳性克隆子的摇瓶发酵  38-39
  2.4 结果与分析  39-42
    2.4.1 TrpEDCBA基因的扩增  39
    2.4.2 重组质粒pMD-trp的构建  39-40
    2.4.3 工程菌MD-trp-06细胞总蛋白电泳  40-41
    2.4.4 邻氨基苯甲酸合成酶活性分析  41
    2.4.5 色氨酸合成酶活性分析  41-42
    2.4.6 MD-trp-06摇瓶发酵  42
  2.5 小结  42-45
第三章 透明颤菌血红蛋白在工程菌中表达及功能研究  45-53
  3.1 前言  45-46
  3.2 实验材料  46
    3.2.1 菌种和质粒  46
    3.2.2 培养基  46
    3.2.3 主要试剂  46
  3.3 实验方法  46-48
    3.3.1 DNA克隆操作  46
    3.3.2 工程菌的发酵培养  46
    3.3.3 细胞总蛋白SDS-PAGE  46
    3.3.4 色氨酸含量测定  46
    3.3.5 表达载体pBR-trp-vgb的构建  46-48
  3.4 结果与分析  48-52
    3.4.1 vgb基因的完整表达框的建立  48-50
    3.4.2 表达载体pMD-trp-vgb的验证  50
    3.4.3 vgb基因序列测定  50
    3.4.4 vgb基因诱导表达  50-51
    3.4.5 vgb基因的表达对菌体生长及产酸能力影响  51-52
  3.5 讨论  52-53
总结与展望  53-55
参考文献  55-61
攻读学位期间承担的科研任务与主要成果  61-63
致谢  63-65
个人简历  65-67

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 发酵法制氨基酸 > 其他
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