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苏氨酸基因工程菌噬菌体抗性菌株选育及摇瓶发酵工艺研究

作　者: 吴晓文
导　师: 刘峰
学　校: 福建师范大学
专　业: 微生物学
关键词: 基因工程菌 L-苏氨酸检测诱变育种摇瓶发酵质粒稳定性
分类号: TQ922
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

本文以基因工程构建菌种大肠杆菌(Escherichia coli) TDH-6 VIC40菌株为出发菌株,采用诱变育种的方法对该菌株进行了噬菌体抗性改造,并对筛选到的噬菌体抗性变株FCD13的相关特性进行了研究。主要研究结果总结如下：1.分别采用薄层层析法、荷移分光光度法对发酵液中的L-苏氨酸进行了定性、定量分析。对荷移分光光度法中影响L-苏氨酸含量测定的因素进行了研究,并用单因素实验优化了实验条件,得出了荷移分光光度法测定L-苏氨酸含量的最佳检测条件,建立了快速测定发酵液中L-苏氨酸含量的方法。最佳检测条件下,L-苏氨酸在5ug/mL-30ug/mL浓度范围内线性关系良好,回归方程为A352nm=0.02414C+0.0597,相关系数为R2=0.9949。2.以基因工程构建菌种大肠杆菌(Escherichia coli) TDH-6 VIC40菌株为出发菌株,经紫外线诱变处理,经初筛、复筛、产酸能力的测定和连续传代实验,定向选育出一株遗传性状稳定的既有噬菌体抗性的能力同时具有较高产酸能力的菌株FCD13。3.研究了菌株FCD13的摇瓶发酵工艺。采用正交设计实验法优化了种子培养基组成配比,采用单因素分析实验法优化了发酵培养基组成配比和发酵培养条件。在优化条件下,菌株FCD13摇瓶发酵48h,可积累L-苏氨酸5.98g/L,相对于FCD13的原始基础培养基有一定的提高。4.研究了FCD13的质粒稳定性。采用单因素实验考察了FCD13菌株在摇瓶发酵的过程中质粒的稳定性,并发现在保种培养基中添加链霉素对菌种的保藏有利。

全文目录

中文摘要  2-3
Abstract  3-5
中文文摘  5-7
目录  7-11
绪论  11-25
  1 L-苏氨酸的理化性质、用途及生产方法  11-16
    1.1 L-苏氨酸的理化性质  11
    1.2 L-苏氨酸的用途  11-12
    1.3 L-苏氨酸的生产方法  12-14
      1.3.1 化学合成法  12
      1.3.2 蛋白质水解提取法  12
      1.3.3 直接发酵法  12-14
    1.4 L-苏氨酸的生产工艺  14-16
      1.4.1 苏氨酸生产的技术关键点  15-16
  2 抗噬菌体工程菌的研究  16-19
    2.1 抵抗噬菌体的作用方式  17-18
    2.2 抵抗噬菌体感染方法  18-19
    2.3 噬菌体污染的检测  19
  3 工程菌质粒稳定性的研究  19-22
    3.1 质粒的选择  20
    3.2 宿主的选择  20
    3.3 选择压力  20-21
    3.4 培养基成分  21
    3.5 培养条件  21
    3.6 菌种传代  21
    3.7 操作方式  21-22
  4 论文的立题背景及主要研究内容  22-25
第一章发酵液中L-苏氨酸的定性定量测定  25-35
  1.1 前言  25
  1.2 实验材料  25-26
    1.2.1 主要仪器  25-26
    1.2.2 主要试剂  26
    1.2.3 相关溶液  26
  1.3 实验方法  26-27
    1.3.1 苏氨酸的定性测定—薄层层析法  26-27
    1.3.2 苏氨酸的定量测定—荷移分光光度法  27
  1.4 结果与讨论  27-33
    1.4.1 L-苏氨酸的定性测定  27-29
    1.4.2 荷移分光光度法中波长的选择  29
    1.4.3 荷移分光光度法中荷移反应条件的影响  29-31
    1.4.4 荷移分光光度法中试剂用量的影响  31-33
    1.4.5 标准曲线的绘制  33
  1.5 本章小结  33-35
第二章苏氨酸基因工程菌噬菌体抗性菌株的选育  35-45
  2.1 前言  35
  2.2 实验材料  35-37
    2.2.1 菌株和噬菌体  35-36
    2.2.2 主要仪器  36
    2.2.3 主要试剂  36
    2.2.4 主要培养基  36-37
  2.3 实验方法  37-39
    2.3.1 菌体生长曲线的测定  37
    2.3.2 菌浓的测定  37
    2.3.3 单细胞悬浮液的制备  37
    2.3.4 紫外线诱变致死率  37-38
    2.3.5 紫外诱变步骤  38-39
    2.3.6 抗噬菌体菌株的筛选  39
    2.3.7 苏氨酸含量的测定方法  39
  2.4 结果与分析  39-44
    2.4.1 菌体生长曲线的绘制  39-40
    2.4.2 对数生长后期菌浓的测定  40-41
    2.4.3 紫外诱变曲线及紫外照射时间的选择  41
    2.4.4 抗性菌株的筛选  41-42
    2.4.5 产酸验证  42-43
    2.4.6 FCD13遗传稳定性测定  43-44
  2.5 结论  44-45
第三章苏氨酸摇瓶发酵工艺的研究  45-63
  3.1 前言  45
  3.2 实验材料  45-46
    3.2.1 菌种  45
    3.2.2 主要仪器  45-46
    3.2.3 主要试剂  46
    3.2.4 培养基  46
  3.3 实验方法  46-47
    3.3.1 菌种活化  46
    3.3.2 种子培养  46
    3.3.3 摇瓶发酵  46-47
    3.3.4 分析方法  47
  3.4 结果与讨论  47-60
    3.4.1 种子培养基优化  47-49
    3.4.2 种子培养时间的确定  49-50
    3.4.3 营养对L-苏氨酸产量的影响  50-56
    3.4.4 环境因素对生产L-苏氨酸的影响  56-60
  3.5 本章小结  60-63
第四章 L-苏氨酸工程菌FCD13质粒稳定  63-71
  4.1 前言  63
  4.2 实验材料  63-64
    4.2.1 菌种  63
    4.2.2 主要仪器  63-64
    4.2.3 主要试剂  64
    4.2.4 主要培养基  64
  4.3 实验方法  64-65
    4.3.1 菌种活化  64
    4.3.2 种子培养  64-65
    4.3.3 工程菌质粒稳定性  65
    4.3.4 分析测定方法  65
  4.4 结果与讨论  65-70
    4.4.1 FCD13的传代对质粒稳定性的影响  65-66
    4.4.2 蔗糖浓度对FCD13质粒稳定性的影响  66-67
    4.4.3 抗生素浓度对FCD13质粒稳定性的影响  67-69
    4.4.4 温度对FCD13质粒稳定性的影响  69-70
    4.4.5 温度的突然改变对FCD13质粒稳定性的影响  70
  4.5 结论  70-71
第五章结论  71-73
参考文献  73-81
攻读学位期间承担的科研任务与主要成果  81-83
致谢  83-85
个人简历  85-87

苏氨酸基因工程菌噬菌体抗性菌株选育及摇瓶发酵工艺研究

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