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大熊猫垂体泌乳素（PRL）基因的克隆与表达

作　者: 郑旭
导　师: 朱睦元
学　校: 浙江大学
专　业: 遗传学
关键词: 大熊猫垂体泌乳素基因克隆同源分析进化建树重组蛋白诱导表达
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

大熊猫是国家一级濒危保护动物，保护大熊猫可以分为就地保护和异地保护二种。就地保护就是建立大熊猫自然保护区，目前国家已经建立了四川省卧龙自然保护区等多个国家级自然保护区。异地保护就是对大熊猫进行人工圈养和人工繁殖，以增加大熊猫的种群数量。但是，在圈养条件下，大熊猫的生殖能力低下，幼仔的存活率不高。目前，这二个问题以成为困扰大熊猫异地保护工作顺利开展的瓶颈。研究表明，大熊猫生殖能力低下可能与生殖激素分泌失调有关：幼仔存活率低与免疫系统的发育不良有关。至今为止，大熊猫生殖、发育和免疫的分子基础都还不清楚。因此，为了解决大熊猫生殖力低下和幼仔成活率低的问题，对大熊猫的生殖、发育和免疫展开分子水平的研究是必要的。垂体泌乳素(PRL)是由脑垂体合成并分泌的一种蛋白类激素，参与了包括生殖、免疫和发育在内的多种生物学功能的调控。本研究针对大熊猫生殖力低下和幼仔成活率低的问题，以为大熊猫泌乳素为研究对象，开展了大熊猫泌乳素的基因克隆、序列分析和体外表达的研究。在研究中，从大熊猫脑垂体中提取了总RNA，利用RT-PCR技术，首次扩增出了大熊猫垂体泌乳素基因的eDNA序列(GenBank登录号为AY161285)。测序结果表明，大熊猫泌乳素基因的开放阅读框长687个核苷酸，编码229个氨基酸；N端前90个核苷酸编码30个氨基酸的信号肽。大熊猫成熟泌乳素含有199个氨基酸残基。研究中，还将克隆的泌乳素基因克隆到表达质粒pGEX-4T-1中，构建了可以在体外表达泌乳素的原核表达载体，质粒pGEX-4T-1—pPRL。用质粒pGEX-4T-1-pPRL转化大肠杆菌BL21，含表达质粒的BL21在异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的诱导下可以表达泌乳素蛋白。SDS-PAGE电泳结果表明表达的泌乳素蛋白分布在不可溶蛋白部分。泌乳素蛋白成熟肽的序列同源性比较结果显示：大熊猫与猪、猫、兔和袋鼠的序列同源性大于90％；与人、牛、山羊、绵羊和鸡的序列同源性在70％—80％之间。与小鼠，大鼠的同源性分别为46.1％和52.2％。有趣的是，大熊猫属真兽亚纲食肉目，袋鼠属后兽亚纲有袋目，二者在进化上相距较远，而二者的泌乳素蛋白序列却很相似。在雄性，泌乳素可以促进生殖腺的功能。在雌性，泌乳素具有维持黄体的功能，因此研究最后讨论了利用大熊猫泌乳素来提高大熊猫生殖能力的可能性。

全文目录

中文摘要  6-8
英文摘要  8-10
引言  10-12
第一章文献综述  12-26
  1 泌乳素的结构  12-13
  2 泌乳素的受体  13-16
  3 泌乳素的生物学功能  16-21
  4 泌乳素的分泌  21-23
  5 泌乳素分泌的调控  23-26
第二章大熊猫泌乳素基因的克隆和序列分析  26-48
  前言  26-27
  1 材料和方法  27-36
    1.1 材料与试剂  27-29
    1.2 实验方法  29-36
      1.2.1 脑垂体总RNA的提取  29
      1.2.2 PCR引物的设计  29-30
      1.2.3 RT-PCR  30-31
      1.2.4 cDNA的克隆  31-34
      1.2.5 重组质粒的PCR鉴定  34
      1.2.6 重组质粒的双酶切鉴定  34-35
      1.2.7 重组质粒的序列测定  35-36
      1.2.8 序列的分析与登录  36
  2 结果与分析  36-46
    2.1 脑垂体总RNA的分离  36-37
    2.2 RT-PCR的产物  37
    2.3 重组质粒的PCR鉴定  37-38
    2.4 重组质粒的双酶切鉴定  38
    2.5 测序结果和序列分析  38-40
    2.6 同源比对和进化树的建立  40-46
  3 讨论  46-48
第三章大熊猫泌乳素基因在大肠杆菌中的表达  48-64
  前言  48
  1 材料和方法  48-59
    1.1 材料与试剂  48-51
    1.2 实验方法  51-59
      1.2.1 目的DNA片段的制备  51-52
      1.2.2 原核表达载体的构建  52-55
      1.2.3 重组表达质粒的PCR鉴定  55
      1.2.4 重组表达质粒的双酶切鉴定  55-56
      1.2.5 泌乳素基因在大肠杆菌BL21中的诱导表达  56-59
  2 结果与分析  59-63
    2.1 目的DNA片段的制备  59
    2.2 重组表达质粒的PCR鉴定  59-60
    2.3 重组表达质粒的双酶切鉴定  60-61
    2.4 泌乳素基因在大肠杆菌BL21中的诱导表达  61-63
  3 讨论  63-64
参考文献  64-71
致谢  71

大熊猫垂体泌乳素（PRL）基因的克隆与表达

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