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氰氟草酯降解菌分离鉴定、降解特性的研究及氰氟草酯水解酶基因（chbH）的克隆和表达

作　者: 聂志娟
导　师: 何健
学　校: 南京农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 氰氟草酯 Pseudomonas sp.QDZ-1 微生物降解 基因克隆和表达 氰氟草酯水解酶基因chbH
分类号: X172
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


氰氟草酯(cyhalofop-buty1)是一种芳氧苯氧羧酸酯类除草剂,其在环境中的迁移、转化和分解等环境行为及其对人类健康的潜在危害正日益受到关注,分离筛选能降解氰氟草酯的微生物并研究其降解机制具有非常重要的理论和应用价值。本文通过对长期受芳氧苯氧丙酸类除草剂污染的稻田土壤中进行富集筛选,分离到五株能降解氰氟草酯菌株,分别命名为QDZ-1, QDZ-A, QDZ-B, QDZ-C, QDZ-D经过形态、生理生化实验及16S rRNA基因序列分析,分别鉴定其属Pseudomonas sp. (QDZ-1), Agromyces sp. (QDZ-A), Stenotrophomonas sp. (QDZ-B), Aquamicrobium sp. (QDZ-C), Microbacterium sp. (QDZ-D).经过对降解效果进行比较,选择一株较高效氰氟草酯降解菌QDZ-1为研究对象,并对其生物学特性进行研究。菌株QDZ-1无芽孢、革兰氏阴性、短杆状、一端生多根鞭毛。在LB固体平板培养两天后,菌落圆形、边缘光滑、呈黄色。能在15℃-37℃生长,最适生长温度为25℃-30℃,菌株QDZ-1在pH5.5-10.0范围内生长良好,当pH低于5.5菌株的生长明显受到抑制,最适pH值为7.0,好氧性生长,QDZ-1的最适生长NaCl浓度是0.5%,当NaCl浓度小于2.5%时,菌体生长良好,当NaCl浓度大于3.5%时,生长受到明显的抑制。菌株QDZ-1能够以氰氟草酯为唯一碳源进行生长,经过5d的培养,降解率达到84.5%。菌株QDZ-1降解氰氟草酯的最适温度为30℃,最适pH为7.0。QDZ-1同样也能降解其他芳氧苯氧羧酸酯类除草剂,5d能降解68.9%的禾草灵,64.6%的精吡氟氯禾灵,92.6%的精喹禾灵,90.8%的精恶唑禾草灵和79.6%的精吡氟禾草灵。菌株和菌株的粗酶液能够在有农药(150 mg/L)的平板上产生水解圈。通过质谱机检测到QDZ-1以氰氟草酯为唯一碳源的液体基础盐培养基中代谢此农药时产生的代谢产物。在对代谢物结构的分析基础上推测了QDZ-1降解氰氟草酯的代谢途径。结果表明QDZ-1在降解氰氟草酯时,首先断裂其结构核心—酯键生成氰氟草酸,其次醚键断裂脱羧,最后氰基酰胺化。通过构建基因组DNA文库,以氰氟草酯水解为氰氟草酸产生的透明水解圈作为氰氟草酯水解酶活力筛选标记,成功从菌株Pseudomonas sp.QDZ-1中克隆到一个新的氰氟草酯水解酶基因,命名为chbH。通过Omiga软件分析chbH具有996碱基得到编码332个氨基酸,分子量为36KDa。ChbH推测的氨基酸序列在NCBI的蛋白序列数据库中比对,结果表示chbH编码蛋白属于酯(脂肪)酶超家族。chbH编码蛋白与一些假设或推测性水解酶相似性最高；与Pseudomonas fluorescens的酯酶,82%的同源性;与Ralstonia eutropha H16的水解酶,50%的同源性;Burkholderia multivorans ATCC17616的α/β-水解酶,48%的同源性。以pET29a为表达载体,构建表达质粒pET29a-chbH,实现了ChbH蛋白在E. coli BL21 (DE3)中的融合表达,并用镍离子亲和层析柱纯化融合蛋白ChbH能水解多种芳氧苯氧丙酸酯类除草剂如精喹禾灵、精恶唑禾草灵、氰氟草酯、禾草灵和精吡氟氯禾灵。水解速率顺序为：精喹禾灵≈精恶唑禾草灵>氰氟草酯>禾草灵≈精吡氟氯禾灵。醇链长度严重影响芳氧苯氧丙酸酯类除草剂的生物降解,对具有相同的醇链长度的不同芳氧苯氧丙酸酯类除草剂拥有相似的降解效率,芳香烃上取代基对此类除草剂的生物降解影响很小

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摘要  8-10ABSTRACT  10-12符号与缩略语说明  12-13前言  13-14文献综述  14-26  1 农药污染现状及农药残留的生物修复  14-16    1.1 农药使用及污染现状  14-15    1.2 农药残留的生物修复  15-16  2 芳氧苯氧丙酸酯类除草剂简介及致毒机理  16-18    2.1 芳氧苯氧丙酸酯类除草剂简介  16-17    2.2 致毒机理  17-18  3 氰氟草酯性质及其降解方式  18-19  4 酯酶的研究简介  19-21  5 论文拟解决的关键问题、研究思路及内容  21    5.1 要解决的关键问题  21    5.2 本文研究思路及研究内容  21  参考文献  21-26第一章 氰氟草酯降解菌的分离与鉴定  26-40  1 材料与方法  26-30    1.1 培养基与试剂  26-27    1.2 降解菌株的筛选和分离  27    1.3 接种菌液的制备  27    1.4 氰氟草酯含量的测定  27    1.5 菌体生长量的测定  27    1.6 降解菌株的培养特征及生理生化鉴定  27-28    1.7 降解菌株的16S rRNA序列的PCR扩增和鉴定  28-30      1.7.1 菌体总DNA的提取  28      1.7.2 降解菌16S rRNA的PCR扩增  28      1.7.3 普通感受态细胞的制备  28-29      1.7.4 质粒DNA的小量提取  29-30      1.7.5 PCR产物的T/A克隆及酶连产物的转化  30      1.7.6 16S rRNA的序列测定  30    1.8 降解菌系统发育地位的确定  30  2. 结果与分析  30-37    2.1 污染土壤中氰氟草酯降解菌株的分离  30-31    2.2 降解菌株的鉴定结果  31-32    2.3 菌株QDZ-1的形态及生理生化特征  32-35    2.4 环境条件对降解菌株QDZ-1生长的影响  35-37      2.4.1 温度对菌株QDZ-1生长的影响  35      2.4.2 pH对菌株QDZ-1生长的影响  35-36      2.4.3 NaCl对菌株QDZ-1生长的影响  36      2.4.4 通气量对菌株QDZ-1生长的影响  36-37  3 本章小结  37-38  参考文献  38-40第二章 氰氟草酯降解菌QDZ-1降解特性及代谢途径的研究  40-50  1 材料与方法  40-41    1.1 培养基与试剂  40    1.2 菌株QDZ-1利用氰氟草酯的生长降解曲线  40-41    1.3 粗酶液的制备  41    1.4 氰氟草酯及其降解产物的提取与检测  41  2 结果与分析  41-48    2.1 菌株QDZ-1以氰氟草酯为碳源的生长及降解试验  41-42    2.2 粗酶液的效果验证  42-43    2.3 菌株QDZ-1的降解特性研究  43-45      2.3.1 温度对菌株QDZ-1降解氰氟草酯的影响  43-44      2.3.2 pH对菌株QDZ-1降解氰氟草酯的影响  44      2.3.3 接种量对菌株QDZ-1降解氰氟草酯的影响  44-45      2.3.4 氰氟草酯起始浓度对菌株QDZ-1降解氰氟草酯的影响  45    2.4 菌株QDZ-1降解氰氟草酯的代谢途径的初步研究  45-48      2.4.1 菌株降解氰氟草酯代谢产物的MS分析  45-46      2.4.2 代谢途径的推测  46-48  3. 本章小结  48-49  参考文献  49-50第三章 氰氟草酯水解酶(ChbH)的基因克隆、表达及纯化  50-70  第一节 氰氟草酯水解酶(ChbH)的基因克隆  50-59    1 材料与方法  50-54      1.1 培养基与试剂  50      1.2 所用菌株和质粒  50-51      1.3 鸟枪法基因文库构建步骤示意图  51      1.4 菌体总DNA的提取,质粒DNA的提取  51      1.5 高效感受态细胞的制备  51-52      1.6 降解菌QDZ-1总DNASau3AⅠ酶切体系  52      1.7 酶切片段的回收  52-53      1.8 酶连  53      1.9 转化和基因文库的构建  53-54      1.10 基因序列分析  54      1.11 阳性克隆子降解氰氟草酯农药的液质检测  54    2 结果与分析  54-59      2.1 菌株QDZ-1的基因组DNA的提取和部分酶切及基因文库的构建  54-56      2.3 阳性克隆测序和ORF分析  56-57      2.4 chbH氨基酸序列分析  57-59  第二节 氰氟草酯水解酶(ChbH)蛋白原核表达和纯化  59-68    1 材料与方法  59-64      1.1 培养基与试剂  59      1.2 菌株和质粒  59      1.3 菌体基因组DNA和质粒DNA的提取  59      1.4 普通感受态细胞制备(BL21)  59-60      1.5 氰氟草酯水解酶基因PCR扩增  60      1.6 PCR产物的纯化及酶切  60      1.7 表达载体pET29a的制备  60      1.8 表达载体的构建  60-62      1.9 氰氟草酯水解酶的诱导表达  62      1.10 ChbH蛋白的Ni-NTA亲和层析纯化  62-64      1.12 ChbH活力测定  64    2 结果与分析  64-68      2.1 chbH的PCR扩增和基因重组表达载体的构建  64-65      2.2 chbH在E.coli BL21中的表达、纯化及SDS-PAGE分析  65-67      2.3 ChbH对不同底物的动力学常数  67-68  本章小结  68-69  参考文献  69-70硕士论文创新点  70-72全文总结  72-74附录  74-82硕士期间发表论文和获得专利  82-84致谢  84

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中图分类: > 环境科学、安全科学 > 环境科学基础理论 > 环境生物学 > 环境微生物学
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