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地被菊匍匐茎横向重力性相关基因的发掘

作　者: 夏胜军
导　师: 陈发棣
学　校: 南京农业大学
专　业: 园林植物与观赏园艺
关键词: 菊花 横向重力性 抑制差减杂交 CmTUB 基因克隆 实时荧光定量
分类号: S682.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


地被菊是一种兼具绿化、美化、彩化和香化功能的菊花新品种群,株型低矮或匍匐,但匍匐型品种奇缺。本课题组近年来选育出了一批株型完全匍匐、茎节部着生气生根、生长旺盛的新品种,具有较高的园林应用价值。在影响植物生长的众多环境因子(光、温度、水分、营养条件及其它生物等)中,重力是决定高等植物形态最重要的环境因子之一。大量研究表明植物枝条的生长方向是光和重力调控茎生长的结果,大多数匍匐生长突变体都与其地上部的重力丧失或钝感有关。然而,目前关于地被菊匍匐生长特性形成的机理尚不明确。本研究采用分子生物学手段构建了匍匐茎弯曲部位的基因文库,探讨了匍匐茎弯曲部位基因表达的特点并对目标基因进行了克隆和表达分析研究,以期揭示匍匐茎形成的分子机理。主要结果如下：(1)以重力处理后的菊花茎组织向地侧cDNA为检测子/驱动子(Tester/Driver),背地侧cDNA为驱动子/检测子(Driver/Tester)进行正反向差减杂交,差减PCR产物克隆转化,分别构建了两个差异表达cDNA文库(向地侧LSSH和背地侧USSH).将SSH文库克隆的PCR产物点膜与32p同位素探针标记,斑点杂交筛选出43个阳性克隆,获得的43个阳性克隆采用载体通用引物进行序列测定都取得了成功,去除载体后对序列进行聚类分析后只获得代表同一个转录产物的3个序列的Contig(重叠群),其余40个序列都为singletons(单元素)。采用B1ASTn, B1ASTx, COG等生物学分析软件对阳性克隆序列进行生物学信息处理与分析后可以分成41个基因族(其中22个来自匍匐茎背地侧,19个来自向地侧),核苷酸序列在NCBI上的登录号为FS999558-FS999598。这些受重力刺激表达的基因覆盖了植物生长的许多方面,多数与细胞壁的生物合成相关,例如微管蛋白、枯草杆菌蛋白酶、谷胱甘肽转移酶、扩张蛋白、脂质转移酶,这些基因在向地侧或背地侧的差异表达可能导致了匍匐茎的向重性弯曲生长。另外一些与离子转运相关的基因也因重力的刺激出现了特异表达,例如硼转运蛋白和锌转运蛋白。(2)通过RT-PCR、RACE技术从地被菊‘雨花金华’中成功克隆了一个p微管蛋白基因,命名为CmTUB,基因登录号为AB608732。序列分析结果发现,地被菊‘雨花金华’CmTUB基因cDNA全长为1544bp,编码446个氨基酸,氨基酸序列由一个包含198个氨基酸残基的GTPase结构域和138个氨基酸残基的C-端组成,并包含6个与微管蛋白连接相关的功能域。系统进化树分析表明与棉花等双子叶植物亲缘关系较近。荧光定量PCR分析结果表明,CmTUB基因属于组成型表达基因,重力可以抑制CmTUB在背地侧的表达；NAA和CaCl2可以促进涂抹侧的表达；TIBA和EGTA则对涂抹侧CmTUB的表达具有抑制作用。

全文目录


摘要  6-8ABSTRACT  8-10缩略词  10-11引言  11-12第一章 文献综述  12-26  1 植物向重力性概述  12-20    1.1 植物向重力性反应形成机理  12-19    1.2 高等植物的向重力性研究展望  19-20  2 植物向重力性的分子生物学研究进展  20-26    2.1 图位克隆法在克隆向重性反应相关基因上的应用  20-23    2.2 抑制差减杂交技术在分离重力响应相关基因上的应用  23-24    2.3 转基因技术在研究向重性基因上的应用  24-26第二章 地被菊匍匐茎背/向地侧抑制差减杂交文库的构建及EST序列分析  26-44  1 材料与方法  26-29    1.1 材料  26    1.2 重力处理与取材  26-27    1.3 总RNA的提取与mRNA的分离纯化  27    1.4 抑制差减杂交  27    1.5 差减cDNA文库的构建(T/A克隆法)  27    1.6 差减文库中cDNA插入片段的PCR鉴定  27-28    1.7 斑点杂交与阳性克隆筛选  28    1.8 阳性克隆序列测定、序列处理与生物信息学分析  28-29  2 结果与分析  29-41    2.1 总RNA和mRNA的质量检测与分析  29-30    2.2 差减cDNA文库构建环节的检测与分析  30-34    2.3 阳性克隆的筛选结果  34-37    2.4 阳性克隆序列的生物信息学分析结果  37-41  3 讨论  41-44第三章 地被菊CmTUB基因的克隆与表达分析  44-66  1 材料与方法  44-53    1.1 材料  44    1.2 试剂与仪器  44    1.3 实验方法  44-53  2 结果与分析  53-64    2.1 总RNA及反转录cDNA的质量检测与分析  53-54    2.2 CmTUB基因的克隆  54-56    2.3 CmTUB基因的序列分析  56-61    2.4 CmTUB基因在不同处理下的表达情况  61-64  3 讨论  64-66全文结论  66-68创新点  68-70参考文献  70-82附录  82-84攻读学位期间发表的论文  84-86致谢  86

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 观赏园艺（花卉和观赏树木） > 多年生花卉类 > 宿根花卉类 > 菊花
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