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苏云金芽孢杆菌CryIAc重组蛋白及土曲霉PNR2发酵产物的杀虫活性研究

作　者: 李翔
导　师: 戴华国；郭坚华
学　校: 南京农业大学
专　业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 苏云金芽孢杆菌 CryIAc重组蛋白 土曲霉 固态发酵产物 杀虫活性生物测定
分类号: S476.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


本研究在一株苏云金芽孢杆菌HD-73中,通过PCR-RFLP方法确定其中含有cryⅠAc基因。根据GenBank中cryⅠAc类基因序列设计引物对ORF-1、ORF-2及COM-1、COM-2,经PCR扩增分别得到cryⅠAc基因的ORF和全长(包含启动子、ORF和终止子)。序列测定结果表明,该基因全长4202 bp, ORF长3537 bp,编码1178个氨基酸,利用Antheprot软件分析,预测其蛋白分子量为133.35 kDa,等电点pI=4.825。经Blast序列比对结果表明,ORF的核酸序列与数个已公布的cryⅠAc类基因同源达99%,编码氨基酸序列的同源性达99.7%。将cryⅠAc基因的ORF克隆至pMD19-T载体上,用Bam HI和SalⅠ进行双酶切,和经相同酶切的pET-30a(+)载体连接,得到重组表达质粒pETcO.将pETcO转化E. coli BL21 (DE3),利用IPTG进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE检测,发现转化菌株ETcO能正确表达CrylAc蛋白,分子量为130 kDa左右。将苏云金芽孢杆菌HD-73于NB液体培养基中进行种子培养后,在1/2 NB液体培养基中发酵72 h,利用等电沉淀法提取了CrylAc原毒素。经SDS-PAGE检测,原毒素蛋白的分子量与上述重组蛋白一致。利用浸叶法,将CryⅠAc重组蛋白对斜纹夜蛾和小菜蛾进行了生物测定,结果对二者均显示了高杀虫活性,LCso分别为2.334μg/ml和4.444μg/ml。Dihydrocitrinone和细胞松弛素N是从本实验室一株土曲霉PNR2经固态发酵后,分离纯化得到的两种次生代谢产物。利用浸叶法将两种化合物对斜纹夜蛾、小菜蛾和烟粉虱进行了生物测定。结果表明,dihydrocitrinone在浓度为200μg/ml时的校正死亡率仅为5.7%(斜纹夜蛾)、3.2%(小菜蛾)、7.4%(烟粉虱)；细胞松弛素N在浓度为200μg/ml时对烟粉虱的校正死亡率为12.5%,对两种鳞翅目昆虫有相对较高的毒力,LCso分别为856.556μg/ml(斜纹夜蛾)和98.026μg/ml(小菜蛾)。

全文目录


摘要  6-7ABSTRACT  7-9第一章 苏云金芽孢杆菌CryⅠAc重组蛋白的杀虫活性研究  9-31  1 文献综述  9-16    1.1 苏云金芽孢杆菌及其杀虫毒素  9-11    1.2 杀虫晶体蛋白(ICPs)  11-14    1.3 cry基因的鉴定、克隆及工程菌的构建  14-16  2 材料与方法  16-23    2.1 试验材料  16-18    2.2 cry基因型的鉴定  18-19    2.3 cryⅠAc基因的克隆及序列分析  19-20    2.4 cryⅠAc基因的表达  20-22    2.5 苏云金芽孢杆菌HD-73中CryⅠAc原毒素的提取  22-23    2.6 cryⅠAc基因表达产物的杀虫活性测定  23  3 结果与分析  23-28    3.1 cry基因型的鉴定  23-24    3.2 cryⅠAc基因的克隆、序列测定及分析  24-26    3.3 cryⅠAc基因的表达及分析验证  26-27    3.4 苏云金芽孢杆菌HD-73中CryⅠAc原毒素的提取  27-28    3.5 表达产物的杀虫活性测定  28  4 讨论  28-31    4.1 cry基因的PCR-RFLP鉴定  28-29    4.2 cryⅠAc基因的克隆及表达  29    4.3 苏云金芽孢杆菌HD-73中CryⅠAc原毒素的提取  29    4.4 表达产物的杀虫活性测定  29-31第二章 土曲霉PNR2固态发酵产物的杀虫活性研究  31-43  1 文献综述  31-38    1.1 真菌次生代谢产物概述  31-32    1.2 真菌杀虫毒素概述  32-37    1.3 Dihydrocitrinone和细胞松弛素N概述及相关化合物的杀虫活性  37-38  2 材料与方法  38-40    2.1 试验材料  38-39    2.2 两种固态发酵产物的杀虫活性测定  39-40  3 结果与分析  40-41    3.1 Dihydrocitronone的杀虫活性  40    3.2 细胞松弛素N的杀虫活性  40-41  4 讨论  41-43参考文献  43-55致谢  55-57在读硕士期间发表的学术论文  57

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 各种防治方法 > 生物防治 > 微生物病源的利用
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