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红肉脐橙和‘国庆四号’温州蜜柑中CHS和CHI基因的克隆与表达及其对类黄酮积累的调控机制

作　者: 李静
导　师: 夏仁学
学　校: 华中农业大学
专　业: 果树学
关键词: 柑橘 类黄酮 查尔酮合成酶 查尔酮异构酶 基因克隆 real-time PCR 相对表达量
分类号: S666.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


类黄酮(Flavonoids)是柑橘果实中抗氧化活性成分的重要来源之一,研究其代谢机制及其合成途径中关键酶基因的表达模式对柑橘类黄酮的开发和利用至关重要。本文以红肉脐橙(Citrus sinensis cv.Cara cara)和‘国庆四号’温州蜜柑(Citrusreticulata Blanco cv.Guoqing NO.4)为试材,克隆类黄酮合成途径中的两个关键酶基因——查尔酮合成酶(CHS)和查尔酮异构酶(CHI),应用real-time PCR技术检测其在果实成熟过程中及不同器官和组织中的相对表达量,结合总黄酮含量及主要类黄酮组分的变化,探讨了CHS和CHI基因的表达模式及其对类黄酮积累的调控机制。主要研究结果如下:1、红肉脐橙和‘国庆四号’温州蜜柑果实成熟过程中总黄酮及三种主要类黄酮组分含量的变化规律。无论是总黄酮还是反式查尔酮、橙皮苷和柚皮素-7-β-芸香糖苷,它们在两品种果皮中的含量均远高于其在同时期果肉中的含量。随着果实的成熟,总黄酮在两品种果皮中的含量均逐渐下降,而在果肉中变幅较小且差异不显著(P＜0.05)。三种类黄酮组分在红肉脐橙果皮和果肉中的含量变化基本一致,均呈双峰变化趋势,即三者含量均先逐渐上升至转色期(11月5日)前后达到其峰值而后逐渐下降,最后又有所升高。随着果实的成熟,三种类黄酮组分在‘国庆四号’温州蜜柑果皮和果肉中的含量均基本呈下降趋势,但在果肉完全成熟时(10月30日)又均有所升高,而果皮中橙皮苷和柚皮素-7-β-芸香糖苷的含量在转色之后的10月20日前后都有一个先显著下降、然后显著升高、再下降的过程(P＜0.05)。2、查尔酮合成酶(CHS)和查尔酮异构酶(CHI)基因克隆及其序列分析。克隆的CHS和CHI基因碱基序列长度分别为1425 bp和731 bp,在GenBank中的登录号分别为FJ887897和FJ887898。序列分析结果显示,其开放读码框(ORF)分别为1176 bp(64～1239 bp,编码392个氨基酸)和669 bp(16～684 bp,编码223个氨基酸)。3、红肉脐橙和‘国庆四号’温州蜜柑果实成熟过程中CHS和CHI基因的相对表达量。CHS和CHI基因在红肉脐橙果皮中均基本呈下调表达趋势,但CHI基因的下调幅度较大;在果肉中均是转色期(11月5日)之后下调表达,之前略有下降但变化不显著(P＜0.05)。两基因在‘国庆四号’温州蜜柑果皮中也均为下调表达,但CHS基因的下调幅度较大;两者在果肉中均基本呈上调表达趋势,但表达量起伏波动较大。4、红肉脐橙和‘国庆四号’温州蜜柑不同器官和组织中的总黄酮含量及CHS和CHI基因的相对表达量。两品种总黄酮含量均是叶中最高、茎次之,根中含量最低,仅分别为其叶中总黄酮含量的7.0%和5.3%。CHS和CHI基因表达在两品种间的差异较大,两基因在红肉脐橙中均是叶中的相对表达量最低,分别为0.02和0.06(均以根中表达量为参照值),其中CHS基因在幼果果肉中的表达量最高(5.52)、茎次之(3.12),CHI基因则是根中最高(1.0)、茎次之(0.65)。两基因在‘国庆四号’温州蜜柑中的相对表达量则均是叶中最高(分别为7.86和2.39)、茎次之(分别为7.81和1.44),CHS和CHI基因在根(1.0)和幼果果肉(0.10)中的相对表达量最低。5、CHS和CHI基因表达对类黄酮积累的调控机制。两品种果实成熟过程中,CHS与CHI基因表达高度相关,其相关系数在红肉脐橙中分别为0.90(果皮中)和0.96(果肉中),在‘国庆四号’温州蜜柑中分别为0.98(果皮中)和0.85(果肉中)。CHS、CHI基因表达与总黄酮含量也高度相关,在红肉脐橙果皮中分别为0.89(CHS)和0.81(CHI),在‘国庆四号’温州蜜柑果皮中分别为0.89(CHS)和0.95(CHI)。此外,两基因表达与‘国庆四号’温州蜜柑果皮中反式查尔酮含量变化的相关系数分别达到了0.94(CHS)和0.99(CHI),与另外两种类黄酮组分的相关性也均较高(r=0.62～0.78)。由此表明,CHS和CHI基因共同构成了柑橘类黄酮合成途径中的限速酶,直接参与类黄酮积累的调控,但由于柑橘果实中其它物质的成分也比较复杂(如糖、酸、类胡萝卜素等),两基因对其类黄酮积累的调控机制还不甚明朗。

全文目录


摘要  7-9ABSTRACT  9-12缩略语表  12-13第一章 前言  13-25  1 课题的提出  13-14  2 类黄酮研究进展  14-22    2.1 类黄酮的结构特点和种类  14-15    2.2 类黄酮的合成途径  15-16    2.3 类黄酮的生物功能及应用  16-18      2.3.1 抗氧化  16-17      2.3.2 参与植物胁迫保护  17      2.3.3 抗炎抗病毒  17      2.3.4 抗癌抗肿瘤  17-18      2.3.5 对心血管系统的作用  18      2.3.6 在食品工业中的应用  18    2.4 类黄酮的提取方法  18-20      2.4.1 传统提取法  18-19      2.4.2 微波提取法  19      2.4.3 超声波提取法  19-20      2.4.4 超临界液体提取法  20      2.4.5 酶提取法  20    2.5 黄酮类成分的检测技术  20-22      2.5.1 光谱分析法  20-21      2.5.2 高效液相色谱法  21      2.5.3 毛细管电泳法  21-22      2.5.4 色谱-质谱联用法  22  3 查尔酮合成酶和查尔酮异构酶研究进展  22-24    3.1 查尔酮合成酶  22-23      3.1.1 编码基因及特征  22-23      3.1.2 CHS基因的表达特性  23    3.2 查尔酮异构酶  23-24      3.2.1 编码基因及特征  23-24      3.2.2 CHI催化反应机理  24  4 本课题研究的内容、目的及意义  24-25第二章 红肉脐橙和‘国庆四号’温州蜜柑果实成熟过程中类黄酮的积累  25-35  1 材料与方法  25-27    1.1 试验材料  25    1.2 主要试剂  25    1.3 主要仪器  25-26    1.4 总黄酮的测定方法  26    1.5 三种主要类黄酮组分的测定方法  26-27      1.5.1 样品溶液的制备  26      1.5.2 标准溶液的配制  26      1.5.3 检测波长的确定  26-27      1.5.4 洗脱条件的选择  27      1.5.5 标准曲线的绘制  27    1.6 数据处理  27  2 结果与分析  27-33    2.1 果实成熟过程中总黄酮含量的变化  27-29      2.1.1 红肉脐橙总黄酮含量的变化  27-28      2.1.2 ‘国庆四号’温州蜜柑总黄酮含量的变化  28-29    2.2 果实成熟过程中三种主要类黄酮组分含量的变化  29-33      2.2.1 红肉脐橙反式查尔酮含量的变化  29-30      2.2.2 红肉脐橙橙皮苷含量的变化  30      2.2.3 红肉脐橙柚皮素-7-β-芸香糖苷含量的变化  30-31      2.2.4 ‘国庆四号’温州蜜柑反式查尔酮含量的变化  31-32      2.2.5 ‘国庆四号’温州蜜柑橙皮苷含量的变化  32      2.2.6 ‘国庆四号’温州蜜柑柚皮素-7-β-芸香糖苷的含量变化  32-33  3 讨论  33-35    3.1 果实成熟过程中总黄酮含量的变化  33    3.2 果实成熟过程中三种主要类黄酮组分含量的变化  33-35第三章 查尔酮合成酶和查尔酮异构酶基因的克隆  35-42  1 材料与方法  35-38    1.1 试验材料  35    1.2 主要试剂  35    1.3 总RNA提取  35-36    1.4 cDNA第一链合成  36    1.5 PCR扩增  36    1.6 PCR产物回收  36-37    1.7 连接与转化  37    1.8 阳性克隆 PCR鉴定及测序  37-38  2 结果与分析  38-40    2.1 总RNA提取  38    2.2 CHS、CHI基因克隆与分析  38-40      2.2.1 红肉脐橙中的PCR结果  38-39      2.2.2 ‘国庆四号’中的 PCR结果  39-40      2.2.3 菌落 PCR检测  40      2.2.4 测序结果及同源性分析  40  3 讨论  40-42第四章 CHS和CHI基因的相对表达量  42-50  1 材料和方法  42-43    1.1 试验材料  42    1.2 试验方法  42-43      1.2.1 总黄酮的测定  42      1.2.2 总RNA提取  42      1.2.3 第一链cDNA反转录  42      1.2.4 Real-time PCR  42-43    1.3 数据统计分析  43  2 结果与分析  43-48    2.1 CHS和CHI基因在红肉脐橙果皮中的相对表达量  43-44    2.2 CHS和CHI基因在红肉脐橙果肉中的相对表达量  44    2.3 CHS和CHI基因在‘国庆四号’果皮中的表达量  44-45    2.4 CHS和CHI基因在‘国庆四号’果肉中的表达量  45-46    2.5 红肉脐橙和‘国庆四号’各组织和器官中总类黄酮含量的变化  46    2.6 CHS和CHI基因在红肉脐橙各组织和器官中的相对表达量  46-47    2.7 CHS和CHI基因在‘国庆四号’各组织和器官中的相对表达量  47-48  3 讨论  48-50    3.1 CHS和CHI基因在果实成熟过程中的相对表达量  48    3.2 不同器官和组织中的总黄酮含量  48-49    3.3 CHS和CHI基因在不同器官和组织中的相对表达量  49-50参考文献  50-59致谢  59-60附录Ⅰ:课题资助项目  60附录Ⅱ:论文发表情况  60

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 柑桔类 > 橙
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