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重组α-环糊精葡萄糖基转移酶酶制剂稳定性的研究

作　者: 郑贤良
导　师: 吴敬
学　校: 江南大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: α-环糊精葡萄糖基转移酶定点突变化学修饰化学添加剂热稳定性圆二色光谱
分类号: Q814
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

环糊精葡萄糖基转移酶(简称CGT酶,EC 2.4.1.19)能够通过分子内转糖苷反应将淀粉及淀粉类似物转化为环糊精。由于环糊精能与客体分子形成包含复合物,改变客体分子的物理和化学性质,因而在食品、医药和化妆品等领域的应用越来越广,CGT酶已成为当今研究的热点。本实验室前期的研究工作中,成功实现了Paenibacillus maceransα-环糊精葡萄糖基转移酶(α-CGT酶)在大肠杆菌中的胞外分泌表达。但研究中我们发现无论是天然α-CGT酶还是重组酶酶制剂的热稳定性均较差,不利于规模化的工业应用。为了提高重组α-CGT酶的稳定性,本研究从基因水平、大分子化学修饰水平和改变酶分子微环境水平三个方面对α-CGT酶的热稳定性开展了研究。此外,用圆二色光谱(CD)分析了α-CGT酶的热稳定性与其天然结构之间的关系,并对多羟基化合物对酶分子的稳定机理做了初步研究。主要研究结果如下：(1)纯化了来源于P. macerans的天然α-CGT酶以及来源于Escherichia coli和Bacillus subtilis的重组酶,经热处理后发现来源于P. macerans, E. coli和B. subtilis的α-CGT酶残酶活分别为28%,30%和25%。可见,来源于不同菌种的α-CGT酶的热稳定性相似,若直接使用,均不能达到工业用酶制剂的要求。根据三种菌对α-CGT酶的产量,最终确定将来源于E. coli的重组α-CGT酶作为本课题后续的研究对象。(2)分析了重组α-CGT酶的最适贮存pH和贮存蛋白浓度。结果显示pH6.5,蛋白含量为4 mg/mL的α-CGT酶热稳定性最好。将蛋白含量为4 mg/mL, pH 6.5的粗酶制剂分别在4℃、25℃和37℃贮存。当酶液在4℃和25℃贮存时,T1/2分别为108 d和50 d,在37℃贮存时α-CGT酶的酶活很快下降,T1/2为2.9 d,一周后酶活完全丧失。(3)采用定点突变技术研究了盐桥对提高重组α-CGT酶热稳定性的影响。对突变体的研究表明,单突变酶CGTM-1(K192R)热稳定性较未突变的没有太大提高;突变三个氨基酸后的突变酶CGTM-3(T185S/I186Y/K192R)热稳定性有了明显提高。在50℃水浴30min后突变酶CGTM-3残酶活是对照的两倍多。将蛋白含量为4 mg/mL, pH 6.5的突变酶CGTM-3粗酶制剂分别在4℃、25℃和37℃贮存,定时取样测酶活,得出其T1/2分别为120 d、80 d和7 d。(4)采用戊二醛交联的方法研究了化学修饰对提高重组α-CGT酶稳定性的影响。α-CGT酶经戊二醛交联成大分子聚合物后,50℃水浴30 min发现与对照相比酶的热稳定性有所提高,但是交联过程中酶活损失了50%。后用α-CGT酶粗酶液进行交联,虽然交联过程酶活损失有所降低,酶的稳定性也有所提高,但仍不能满足工业化应用要求。(5)采用向α-CGT酶液中添加化学添加剂研究了酶分子微环境的改变对提高重组α-CGT酶的稳定性的影响。当单独加入各种保护剂在50℃水浴1 h和室温放置108 d后,发现含有20%甘油的酶液稳定性最好,与未加任何添加剂的对照酶液相比仍有91%和50%的酶活,对照酶液在50℃水浴1 h后仅有小于10%的活性,室温放置108 d后已经没有酶活。明胶、CaC12和PEG400也有一定的保护效果。将四种保护剂分别以最佳浓度组合叠加添加到α-CGT酶发酵液中40℃贮存45 d,发酵液中α-CGT酶的残酶活几乎不变,维持在100%左右。采用圆二色谱(CD)研究不同条件下酶的热稳定性变化与蛋白质构象变化之间的关系。发现保护剂有利于维持酶天然三维构象,明显降低高温条件下α-CGT酶的变性程度,使酶在高温时仍保持较高的酶活。此外,通过不同分子量的PEG和甘油对α-CGT酶保护效果的研究发现,多羟基化合物的羟基含量可能是影响α-CGT酶分子热稳定性的重要因素。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-9
第一章绪论  9-15
  1.1 环糊精概述  9-10
    1.1.1 环糊精的组成与结构  9-10
    1.1.2 环糊精的功能与应用  10
  1.2 环糊精葡萄糖基转移酶(CGT酶)概述  10-13
    1.2.1 CGT酶的三维结构  10-11
    1.2.2 CGT酶的功能  11-12
    1.2.3 CGT酶的应用  12-13
  1.3 CGT酶稳定性的国内外研究现状  13
  1.4 提高酶分子稳定性的研究概况  13-14
  1.5 课题研究的目的和意义  14
  1.6 主要研究内容  14-15
第二章实验材料与方法  15-23
  2.1 质粒和菌株  15
  2.2 试剂与仪器  15-16
    2.2.1 主要试剂  15
    2.2.2 主要仪器  15-16
  2.3 培养方法  16
    2.3.1 培养基  16
    2.3.2 种子培养  16
    2.3.3 摇瓶发酵  16
  2.4 分子生物学操作  16-19
    2.4.1 突变体的构建与转化  16-17
    2.4.2 E. coli电转化感受态细胞的制备  17-18
    2.4.3 电击转化  18
    2.4.4 质粒DNA的提取  18
    2.4.5 质粒DNA的酶切验证  18
    2.4.6 DNA琼脂糖凝胶电泳  18-19
  2.5 分析方法  19-23
    2.5.1 α-CGT酶粗酶液的制备  19
    2.5.2 蛋白质浓度的测定  19
    2.5.3 α-CGT酶环化活力的测定  19
    2.5.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测表达产物  19-20
    2.5.5 α-CGT酶的纯化  20
    2.5.6 不同来源的纯化α-CGT酶热稳定性比较  20
    2.5.7 α-CGT酶最适贮存浓度和pH的选择  20
    2.5.8 突变α-CGT酶的结构模拟  20
    2.5.9 α-CGT酶的化学修饰  20-21
    2.5.10 α-CGT酶保护剂的筛选及浓度优化  21
    2.5.11 α-CGT酶粗酶液长期贮存情况研究  21
    2.5.12 保护剂对α-CGT酶长期贮存保护效果的研究  21
    2.5.13 α-CGT酶的热稳定性与其结构变化的研究  21-22
    2.5.14 甘油提高α-CGT酶热稳定性机理的初步研究  22-23
第三章结果与讨论  23-45
  3.1 不同来源α-CGT酶稳定性研究  23-27
    3.1.1 不同来源α-CGT酶粗酶制剂的稳定性  23-24
    3.1.2 不同来源的α-CGT酶的纯化  24-25
    3.1.3 不同来源的纯化α-CGT酶的热稳定性比较  25
    3.1.4 pH和蛋白浓度对α-CGT粗酶制剂稳定性的影响  25-26
    3.1.5 温度对α-CGT酶粗酶制剂贮存稳定性的影响  26-27
  3.2 定点突变形成盐桥对重组α-CGT酶稳定性的影响  27-31
    3.2.1 重组α-CGT酶的定点突变  28
    3.2.2 重组α-CGT酶和突变α-CGT酶的表达  28-29
    3.2.3 重组和突变α-CGT酶的热稳定性比较  29-30
    3.2.4 盐桥与α-CGT酶热稳定性的相关性  30-31
  3.3 化学修饰对重组α-CGT酶稳定性的影响  31-36
    3.3.1 纯化重组α-CGT酶的戊二醛交联及其稳定性分析  32-34
    3.3.2 重组α-CGT酶粗酶液的戊二醛交联及其稳定性分析  34-36
  3.4 化学添加剂对重组α-CGT酶稳定性的影响  36-45
    3.4.1 化学添加剂的筛选  36-37
    3.4.2 化学添加剂对酶制剂贮存稳定性的影响  37-40
    3.4.3 α-CGT酶天然构象与热稳定性之间的相关性  40-43
    3.4.4 甘油提高α-CGT酶热稳定性的机理  43-45
第四章结论与展望  45-47
  4.1 结论  45-46
  4.2 展望  46-47
致谢  47-49
参考文献  49-59
附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文  59

重组α-环糊精葡萄糖基转移酶酶制剂稳定性的研究

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