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抗鼻咽癌单域抗体与硫酸博来霉素偶联物抗肿瘤特性的初步研究

作　者: 刘春梅
导　师: 任彩萍
学　校: 中南大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 单域抗体 鼻咽癌 原核表达 靶向抗肿瘤效应
分类号: R739.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 28次
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内容摘要


目的：对抗鼻咽癌噬菌体单域抗体HNSA039特异性进行鉴定,构建、表达抗鼻咽癌单域抗体HNSA039和大肠杆菌硫氧还蛋白(TrxA)融合蛋白,并对融合蛋白与硫酸博来霉素(Bleomycin, BLM)偶联物的靶向抗肿瘤特性进行初步研究。方法：利用鼻咽癌细胞系和非鼻咽癌细胞系对单域抗体HNSA039的特异性进行免疫细胞化学鉴定。构建单域抗体HNSA039与大肠杆菌硫氧还蛋白(TrxA)融合基因的原核表达载体pET-21 a(+)/TrxA-HNS A039,转化大肠杆菌BL21 (DE3),进行IPTG诱导表达。在变性条件下纯化融合蛋白TrxA-HNSA039,进行SDS-PAGE电泳鉴定和酶联免疫吸附法(ELISA)检测融合蛋白的免疫活性。以葡聚糖T40为中介体偶联融合蛋白TrxA-HNSA039与BLM,利用流式细胞周期分析、MTT、克隆形成实验检测其对鼻咽癌细胞系(CNE2)和人肺癌细胞系(A549)的抗肿瘤效应。结果：通过对噬菌体重链单域抗体HNSA039的免疫细胞化学鉴定,发现单域抗体HNSA039与CNE2呈较强阳性反应,而与其它人肿瘤细胞系和正常细胞系反应呈弱阳性或不反应。成功构建的重组表达载体pET-21 a(+)/TrxA-HNS A039,经IPTG诱导后表达形式分析显示,融合蛋白主要以包涵体的形式存在,SDS-PAGE电泳显示分子量大约为23KD；ELISA结果显示融合蛋白与CNE2具有较好的结合活性。通过流式细胞周期分析、MTT、克隆形成实验检测TrxA-HNSA039与硫酸博来霉素偶联物(TrxA-HNSA039-BLM)的抗肿瘤活性,结果显示偶联物的抗肿瘤活性比抗体药物混合物抗肿瘤活性显著下降,差别有统计学意义(P<0.05),而对靶细胞系(CNE2)和人肺癌细胞系(A549)抗肿瘤活性差别没有统计学意义(P>0.05)。结论：免疫细胞化学结果显示单域抗体HNSA039具有较好的鼻咽癌细胞特异性。成功构建TrxA-HNSA039的原核表达载体,然后表达并纯化TrxA-HNSA039融合蛋白。ELISA实验结果显示,融合蛋白TrxA-HNSA039具有较好的识别鼻咽癌细胞的免疫活性,而体外细胞实验结果显示TrxA-HNSA039-BLM没有明显的靶向抗鼻咽癌活性。为了更好地研究单域抗体HNSA039,我们准备融合单域抗体HNSA039基因或将单域抗体融合其它抗原识别结构,构建双价抗体增加其抗原识别特性,与“弹头”药物进行直接偶联进行靶向抗鼻咽癌研究。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-11
缩写词简表  11-12
前言  12-16
技术路线简图  16-17
第一章 材料和方法  17-29
  1.1 实验材料  17-19
    1.1.1 噬菌体阳性克隆HNSA039由本所肿瘤免疫生物学研究室从噬菌体抗体库筛选获得  17
    1.1.2 细胞株  17
    1.1.3 菌株  17
    1.1.4 质粒  17-18
    1.1.5 引物  18
    1.1.6 主要试剂  18
    1.1.7 主要仪器  18-19
  1.2 实验方法  19-29
    1.2.1 噬菌体抗体HNSA039 DNA序列测序  19
    1.2.2 各种细胞常规培养  19
    1.2.3 免疫细胞化学鉴定  19-20
    1.2.4 构建HNSA039表达载体  20-22
    1.2.5 融合蛋白TrxA-HNSA039在E.coli BL21(DE3)中的诱导表达  22-23
    1.2.6 融合蛋白TrxA-HNSA039纯化、复性及鉴定  23-24
    1.2.7 ELISA法检测融合蛋白TrxA-HNSA039的效价  24-25
    1.2.8 光镊技术检测融合蛋TrxA-HNSA039与靶细胞的结合率  25
    1.2.9 硫酸博来霉素与融合蛋白TrxA-HNSA039的偶联及偶联物的纯化  25-26
    1.2.10 考马斯亮蓝法测定偶联物中各种组分的含量  26
    1.2.11 MTT比色法测定偶联物的体外细胞毒作用  26-27
    1.2.12 流式细胞仪检测细胞周期  27
    1.2.13 平板克隆形成实验测定细胞群体依赖性和增殖能力  27-29
第二章 实验结果  29-44
  2.1 噬菌体抗体HNSA039第1号阳性克隆基因测序和分析  29-30
  2.2 免疫细胞化学分析  30-32
  2.3 HNSA039表达载体构建及鉴定  32-36
  2.4 TrxA-HNSA039融合蛋白大小预测  36
  2.5 TrxA-HNSA039融合蛋白的诱导表达条件的优化  36
  2.6 TrxA-HNSA039融合蛋白的表达分析、纯化和复性  36-37
  2.7 TrxA-HNSA039融合蛋白Western blot鉴定  37
  2.8 ELISA法检测TrxA-HNSA039融合蛋白的结合活性  37-38
  2.9 光镊技术微球法检测融合蛋白与靶细胞的结合率  38-39
  2.10 偶联物中TrxA-HNSA039融合蛋白和硫酸博来霉素的含量  39-40
  2.11 MTT法测定不同浓度药物细胞毒性  40-41
  2.12 偶联药物对细胞周期的影响  41-42
  2.13 平板克隆形成实验测定细胞群体依赖性和增殖能力  42-44
第三章 讨论  44-50
  3.1 原核表达系统的选择  44
  3.2 诱导条件的优化及蛋白复性系统的选择  44-45
  3.3 抗体的结合活性和靶向性鉴定  45
  3.4 偶联方法的选择  45-46
  3.5 偶联物纯化、组分测定方法的选择  46
  3.6 偶联物的抗肿瘤特性的初步研究  46-48
  3.7 抗体药物在头颈部肿瘤中研究现状  48-50
结论  50-51
参考文献  51-56
综述  56-63
  参考文献  60-63
致谢  63-64
攻读学位期间主要研究成果目录  64

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 耳鼻咽喉肿瘤
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