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栽培大豆和滩涂野大豆及其杂交后代CLC1基因鉴定和功能的初步研究

作　者: 曹金花
导　师: 於丙军
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物学
关键词: 野生大豆 栽培大豆 杂交后代 氯离子通道基因(CLC1) 半定量RT-PCR 亚细胞定位 原核表达
分类号: S565.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


本文以栽培大豆N23674品种(耐盐性较弱)和滩涂野生大豆BB52种群(耐盐性较强)及其经逐代耐盐性筛选的杂交后代4076、4013(F5)幼苗为材料,目的在于阐明氯离子通道基因(CLC1)在利用滩涂野大豆提高栽培大豆耐盐性过程中的作用及其分子机理,为选育适合在我国沿海滩涂生态环境下种植的耐盐、具有优良农艺性状和品质的栽培大豆新品系或新品种提供理论依据。用150 mmol·L-1 NaCl (1/2 Hoagland溶液配制)处理栽培大豆N23674和野生大豆BB52及其杂交后代4076、4013(F5)株系0、1、4、8、12 h。以已公布的GmCLC1(GenBank注册号：AY972079)cDNA序列为模板,根据不同试验目的利用Primer Premier 5.0设计引物：设计半定量RT-PCR引物,通过半定量RT-PCR方法比较盐胁迫下不同大豆材料CLC1 mRNA的丰度；设计全长引物,经RT-PCR克隆获得不同大豆材料CLC1基因完整开放阅读框(ORF),并进行序列分析。在已获得的CLC1基因完整ORF两端引入AscI、Hpal酶切位点,构建瞬时表达载体PSlaGFP-8-CLCl,用基因枪法进行CLC1蛋白亚细胞定位。构建原核表达载体pET30a(+)-CLCl,在已获得的CLC1基因完整ORF两端引入EcoRI、XhoI酶切位点,转化大肠杆菌BL21细胞,通过IPTG诱导外源基因表达。半定量RT-PCR研究结果表明,在盐胁迫12h的过程中,BB52根中CLCl mRNA的丰度表现持续快速积累的特点,叶片中的响应虽较迟缓,但在12h时也积累到较高水平。在N23674根中CLC1 mRNA也表现出积累趋势,但响应时间较BB52推迟(盐处理8h以后),丰度也略低；叶中也表现一定程度的增强,但在整个盐处理过程中表现相对稳定。两后代4013和4076株系的变化则介于两亲本之间。本实验室在供试大豆材料中扩增到的CLCl基因cDNA全序列与已报道的GmCLCl的cDNA全序列进行比对的结果表明,供试3材料的ORF序列完全一致,却都与已报道的GmCLCl的ORF序列存在3个碱基的差异,进而造成2处氨基酸发生改变[R(精氨酸)变为L(亮氨酸),前者是碱性氨基酸,而后者是酸性氨基酸]。基因枪轰击后通过报告基因GFP检测,发现带有目的基因的GFP信号定位于洋葱表皮细胞的液泡膜上,表明CLC1是一个定位于液泡膜上的蛋白质。pET30a(+)-CLC1质粒转化大肠杆菌BL21,在IPTG诱导后,目标基因在原核细胞中得到有效表达。通过半定量RT-PCR、亚细胞定位等试验结果表明,供试的不同大豆材料间耐盐性的差异可能与定位在液泡膜上的氯离子通道蛋白(CLC1)有着密切的关系。

全文目录


摘要  6-8ABSTRACT  8-10符号及缩略语  10-11第一章 文献综述 离子平衡调节基因及其在植物耐盐基因工程中的作用  11-21  1 耐盐性相关的离子平衡调节基因与植物耐盐性的关系  11-15    1.1 植物Na~+/H~+逆向转运蛋白  11-12      1.1.1 质膜Na~+/H~+反向转运蛋白基因(Salt Overly Sensitive,SOS1)  12      1.1.2 液泡膜Na~+/H~+反向转运蛋白基因(Na~+/H~+antiporter,NHX1)  12    1.2 植物H~+-ATPase基因(PMA4)、H~+-PPiase基因(AVP1)  12-13    1.3 植物K~+、Na~+转运蛋白  13      1.3.1 低亲和性K~+转运蛋白  13      1.3.2 高亲和性K~+转运蛋白  13    1.4 植物Cl~-通道(chloride channels,CLCs)蛋白  13-15      1.4.1 质膜Cl~-通道  14      1.4.2 液泡膜Cl~-通道  14      1.4.3 其他Cl~-通道  14-15  2 离子平衡调节基因在植物耐盐基因工程中的研究进展  15-20    2.1 NHX基因  15-17    2.2 SOSl基因  17-18    2.3 PMA4基因和AVP1基因  18    2.4 OsKAT1基因  18-19    2.5 CLCs基因  19-20  3 结语  20-21第二章 研究报告 栽培大豆和滩涂野大豆及其杂交后代CLC1基因鉴定和功能的初步研究  21-51  1. 试验材料与方法  22-35    1.1 材料  22-25      1.1.1 植物材料与培养  22-23      1.1.2 菌株和质粒  23      1.1.3 主要缓冲液、试剂及抗生素  23      1.1.4 培养基  23-24      1.1.5 PCR引物  24-25    1.2 方法  25-35      1.2.1 植株叶片和根部总RNA的提取  25      1.2.2 RNA定量和完整性检测  25      1.2.3 半定量RT-PCR分析  25-26      1.2.4 PCR扩增cDNA全长  26-27      1.2.5 PCR产物电泳检测  27      1.2.6 PCR产物的回收与连接  27-28      1.2.7 CaCl_2法制备大肠杆菌感受态细胞(JM109)  28      1.2.8 目的片段的转化及阳性克隆的鉴定  28-29      1.2.9 质粒DNA的抽提  29-30      1.2.10 酶切  30      1.2.11 T4连接及转化  30-31      1.2.12 验证阳性克隆  31      1.2.13 PS1aGFP-8-CLC1瞬时表达载体的构建  31-32      1.2.14 pET30a(+)-CLC1原核表达载体的构建  32      1.2.15 洋葱表皮细胞培养  32      1.2.16 金粉包裹PS1aGFP-8-CLC1质粒  32-33      1.2.17 基因枪轰击转化  33-34      1.2.18 pET30a(+)-CLC1融合蛋白的诱导表达  34      1.2.19 生物信息学分析  34-35  2. 结果与分析  35-46    2.1 RNA定量和完整性分析  35-36    2.2 RT-PCR检测  36-37    2.3 半定量RT-PCR分析  37-38    2.4 全长序列测序结果分析  38-41    2.5 CLC1蛋白序列的跨膜区域预测  41-42    2.6 CLC1的亚细胞定位  42-44    2.7 CLC1基因的原核表达  44-46  3. 讨论  46-51    3.1 大豆总RNA提取的技术分析  46-47    3.2 大豆CLC1基因在不同品种中的序列比对分析  47    3.3 盐胁迫下不同大豆材料CLC1基因丰度变化分析  47-49    3.4 大豆CLC1蛋白的亚细胞定位和CLC1基因原核表达  49-51全文结论  51-53创新性  53-55存在问题与展望  55-57参考文献  57-65攻读硕士学位期间发表的论文  65-67附录  67-75  附录Ⅰ:pEASY-Blunt Cloning Vector质粒的图谱(Trans)  67-68  附录Ⅱ:PS1aGFP-8瞬时表达载体结构图  68-69  附录Ⅲ:大肠杆菌表达载体pET-30a(+)的图谱  69-70  附录Ⅳ:试剂配方  70-73  附录Ⅴ:培养基配方  73-75致谢  75

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 油料作物 > 大豆
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