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兔支气管败血波氏杆菌fimN基因的克隆表达及快速检测方法的建立

作　者: 章春桃
导　师: 鲍国连
学　校: 浙江师范大学
专　业: 动物学
关键词: 支气管败血波氏杆菌 fimN基因 PCR 原核表达蛋白纯化 ELISA
分类号: S858.291
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

兔支气管败血波氏杆菌病是由支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)引起的一种家兔呼吸道传染病,常呈地方性流行,多为慢性,急性败血性死亡较少。该病病程长,反复发生,难治愈,给养兔业带来了严重的的经济损失。Bb的菌毛蛋白兼具毒力因子及免疫原的特性,其免疫原性已被证实。对fimN基因进行克隆表达和免疫原性分析,以重组蛋白为检测抗原建立间接ELISA诊断方法,为兔波氏杆菌临床快速检测和研制高效疫苗奠定良好的基础。本研究一共分为四部分内容,第一部分采用PCR技术扩增并克隆兔支气管败血波氏杆菌的fimN基因；第二部分以大肠杆菌原核pET-28a(+)为表达系统进行fimN基因的表达、纯化及表达蛋白免疫原性分析；第三部分是兔支气管败血波氏杆菌PCR检测方法的建立；第四部分是兔支气管败血波氏杆菌间接ELISA诊断方法的建立。根据兔支气管败血波氏杆菌菌毛蛋白的fimN基因序列,设计一对特异性引物,扩增出648bp的目的基因片段,将产物与pMD-19T载体连接,阳性质粒经双酶切和测序鉴定,结果表明,扩增的fimN基因与参考序列同源性可高达99%,成功构建了克隆载体。对pMD19T-fimN以及表达载体pET-28a(+)双酶切,连接转化后,获得重组质粒pETBb-fimN,双酶切和序列鉴定结果表明目的基因的插入位置和方向正确,加入IPTG诱导后经SDS-PAGE检测得到的目的蛋白大小约为27KD, Western blot检测结果显示,表达的蛋白能与Bb全菌阳性血清发生特异性结合,为后续的以重组fimN蛋白为包被抗原来建立间接ELISA快速诊断方法奠定基础。根据GenBank中支气管败血波氏杆菌fimN基因的短片段序列设计了一对特反应,且检出最低浓度为10pg,说明该方法敏感性高,特异性强,可用于临床检测。以表达并纯化的fimN蛋白为包被抗原,用fimN蛋白免疫实验兔制备血清作为阳性血清。优化反应条件,确定抗原和血清的最佳工作浓度,最佳封闭液、酶标二抗和血清的最佳作用时间,得出了阴性血清临界值为0.267,敏感性和特异性试验表明,该方法特异性强,敏感性高,用建立的间接ELISA方法检测随机采集的50份兔血清,结果显示阳性率为58%。该方法的建立为Bb血清学检测提供了新途径。

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摘要 4-6ABSTRACT 6-8目录 8-12符号说明 12-13文献综述 13-26 1 支气管波氏杆菌的研究概况 13-19 1.1 形态和培养特性 13-14 1.2 抗原 14-15 1.3 毒素 15-17 1.3.1 腺苷环化酶溶血素 16 1.3.2 皮肤坏死毒素或不耐热毒素 16-17 1.3.3 气管细胞毒素 17 1.4 其它生物学特性 17-19 1.4.1 丝状血凝素 17 1.4.2 百日咳杆菌黏附素 17-18 1.4.3 菌毛 18 1.4.4 Ⅲ型分泌系统(type-Ⅲ secretion system) 18-19 2 支气管波氏杆菌病的研究现状 19-21 2.1 支气管败血波氏杆菌病的流行性病学 19-20 2.2 支气管败血波氏杆菌病的临床症状及病理变化 20 2.3 支气管败血波氏杆菌病的防治措施 20-21 3 支气管败血波氏杆菌病诊断方法的研究 21-23 3.1 普通细菌学检测方法 21 3.2 血清学诊断方法 21-22 3.3 聚合酶链式反应(PCR)检测方法 22-23 3.4 16SrRNA测序 23 4 支气管波氏杆菌菌毛蛋白研究进展 23-26第一章兔支气管败血波氏杆菌FIMN基因的克隆 26-35 1 材料 26-27 1.1 菌种和质料 26-27 1.2 主要试剂 27 2 方法 27-31 2.1 fimN基因的扩增与克隆 27-28 2.1.1 Bb基因组DNA的提取 27 2.1.2 fimN引物设计和合成 27 2.1.3 PCR反应扩增体系 27-28 2.1.4 PCR产物的纯化 28 2.2 目的基因的克隆 28-30 2.2.1 产物与T载体连接 29 2.2.2 感受态细胞制备 29 2.2.3 转化 29-30 2.3 重组质粒的提取与鉴定 30-31 2.3.1 小量提取质粒(碱裂解法) 30 2.3.2 重组质粒的鉴定 30-31 3 结果 31-33 3.1 fimN基因的扩增 31-32 3.2 fimN在T载体中的克隆及鉴定 32-33 3.2.1 PCR法鉴定 32 3.2.2 重组质粒酶切鉴定 32-33 3.2.3 目的基因的序列分析 33 4 讨论 33-35第二章 FIMN基因的表达及免疫原性分析 35-46 1 材判 35-36 1.1 质粒和菌种 35 1.2 主要试剂 35-36 2 方法 36-40 2.1 fimN基因原核表达载体的构建 36-37 2.1.1 重组质粒DNA的双酶切处理及产物的回收 36-37 2.1.2 连接反应 37 2.1.3 连接产物转化 37 2.1.4 重组质粒的提取及鉴定 37 2.2 fimN基因的诱导表达及条件优化 37-39 2.2.1 重组质粒pET28a-fimN转化 37-38 2.2.2 重组质粒在大肠杆菌中的表达 38 2.2.3 IPTG诱导培养时间的优化 38-39 2.3 表达蛋白的纯化 39 2.3.1 包涵体的获取与裂解 39 2.3.2 重组表达蛋白的纯化 39 2.4 重组表达蛋白的免疫原性分析 39-40 3 结果 40-44 3.1 fimN的原核表达载体的构建 40-41 3.2 fimN基因的表达及条件优化 41-43 3.2.1 fimN基因的表达 41-42 3.2.2 表达时间优化 42-43 3.3 重组表达蛋白的纯化 43 3.4 重组表达蛋白的免疫原性分析 43-44 4 讨论 44-46第三章支气管败血波氏杆菌PCR检测方法的建立 46-56 1 材料 46-47 1.1 菌种 46-47 1.2 主要试剂 47 2 方法 47-50 2.1 引物设计与合成 47 2.2 模板DNA的制备 47 2.3 PCR反应体系 47-48 2.4 PCR反应条件优化 48-49 2.4.1 最佳退火温度 48 2.4.2 MgCl_2浓度梯度 48-49 2.4.3 引物最佳浓度 49 2.5 PCR敏感性试验 49 2.6 PCR特异性试验 49 2.7 PCR扩增产物的克隆及目的片段的序列分析 49-50 2.8 分离株的检测 50 3 结果 50-53 3.1 PCR扩增 50 3.2 PCR反应条件优化 50-51 3.3 PCR敏感性试验 51-52 3.4 PCR特异性试验 52 3.5 PCR扩增产物的克隆及目的片段的序列分析 52-53 3.6 PCR法检测分离株 53 4 讨论 53-56第四章支气管败血波氏杆菌间接ELISA诊断方法建立 56-67 1 材料 56-57 1.1 抗原 56 1.2 血清 56 1.3 主要试剂 56-57 2 方法 57-60 2.1 阳性血清的制备 57 2.2 ELISA最佳反应条件的选择 57-59 2.2.1 抗原包被最佳浓度和阳性血清最适浓度的选择 57-58 2.2.2 最佳封闭液的确定 58 2.2.3 封闭时间的确定 58 2.2.4 阴阳性血清最佳反应时间的确定 58 2.2.5 酶标抗体作用时间的选择 58-59 2.2.6 ELISA结果判定 59 2.3 敏感性试验 59 2.4 交叉反应试验 59 2.5 阻断试验 59-60 2.6 重复性试验 60 2.7 ELISA方法的应用 60 3 结果 60-66 3.1 抗原包被最佳浓度和阳性血清最适浓度的选择 60-61 3.2 最佳封闭液的确定 61 3.3 最佳封闭时间 61-62 3.4 阴阳性血清最佳反应时间的确定 62 3.5 酶标抗体最佳作用时间的选择 62-63 3.6 ELISA结果判定 63 3.7 敏感性试验 63-64 3.8 交叉反应试验 64 3.9 阻断试验 64-65 3.10 重复性试验 65-66 3.11 ELISA方法的应用 66 4 讨论 66-67结论 67-68参考文献 68-75附录常用缓冲液及溶液配制 75-79致谢 79-80攻读学位期间取得的研究成果 80-81

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