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栽培大豆和滩涂野大豆及其杂交后代苗期耐盐性与NHX1基因功能的初步研究

作　者: 周其好
导　师: 於丙军
学　校: 南京农业大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 滩涂野大豆 栽培大豆 杂交后代 液泡膜NHX1基因 表达载体 耐盐性 亚细胞定位 原核表达
分类号: S565.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


本研究以栽培大豆N23674品种(耐盐性较弱)和滩涂野生大豆BB52种群(耐盐性较强)及其经逐代耐盐性筛选的杂交后代4076株系(F5代)幼苗为材料,用150mmol·L-1 NaCl溶液胁迫不同时间后,测定和分析叶和根中Na+、K+和C1-含量变化。提取叶中DNA,通过抗盐标记基因PCR方法比较和分析了供试3大豆材料的耐盐性强弱。使用半定量RT-PCR方法分析了大豆叶和根中Na+/H+逆向运转蛋白基因NHX1 mRNA水平的盐胁迫响应差异。分别构建表达载体使NHX1基因在洋葱表皮细胞及大肠杆菌BL21中进行表达,研究NHX1基因的表达位点及相应蛋白的表达情况。主要结果如下：在150 mmol·L-1 NaCl溶液处理大豆幼苗0 h、1 h、4 h、8 h、12 h、2 d和4d后,供试大豆叶和根中Na+和Cl-含量均随盐胁迫时间延长而上升,K+含量随盐胁迫时间延长下降,与N23674相比,盐胁迫下滩涂野大豆BB52种群和及它们的杂交后代4076(F5代)株系(尤其是前者)植株K+含量降幅和Na+增幅均较小,但吸收的Cl-在根中积累较多,而向叶片运输较少。采用抗性标记基因PCR的结果表明：BB52和4076中均扩增出两条条带,一条为约740bp的耐盐基因分子标记带,一条为约620bp的盐敏感基因分子标记带,N23674中仅扩增出一条约620bp的盐敏感基因分子标记带。根据GenBank中GmNHX1 (序列登录号为AY972078)基因的cDNA序列,在供试3材料中扩增出NHX1全长序列,发现除BB52种群第150个碱基为T,N23674品种和4076株系及发表序列此处碱基均为C外,其余碱基间无差异,但该处碱基差异并未造成氨基酸序列的差异。半定量RT-PCR结果表明,在非盐处理下栽培大豆N23674中NHXl基因mRNA丰度高于BB52和4076。150 mmol·L-1 NaCl胁迫12h过程中,3大豆叶和根中NHX1基因mRNA丰度均表现出升高趋势,其中N23674叶和根中NHX1基因响应较BB52迅速,但表达丰度增加量低于BB52,4076则介于两者之间。将NHXl基因插入瞬时表达载体pBI121-GFP中,利用基因枪转化法将pBI121-GFP-NHX1质粒转入洋葱表皮细胞,在其中央大液泡周围能观察到强烈荧光信号,可以判断该基因编码蛋白定位于液泡膜上。构建原核表达载体pET-30-NHX1,并转入大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导后的SDS-PAGE电泳表明NHX1基因可在BL21中高效表达。上述研究结果表明：盐胁迫下供试的3大豆材料根、叶中Na+、K+和Cl-含量变化及耐盐分子标记基因PCR结果与它们的耐盐性差异是一致的。NHX1基因表达的蛋白定位在液泡膜上,该基因表达量与供试大豆的耐盐性强弱呈正相关性。该基因在BL21中的高效表达也为该蛋白的抗体制备及western blot研究奠定了基础。

全文目录


缩略语  5-6摘要  6-8Abstract  8-10第一章 文献综述  10-20  1 植物耐盐性生理机制研究  10-12    1.1 盐胁迫对植物的伤害  10    1.2 植物对盐胁迫的适应性  10-12  2 植物Na~+/H~+逆向转运蛋白的分子生物学研究及应用  12-17    2.1 细胞膜Na~+/H~+逆向转运蛋白的克隆及结构特征  12    2.2 液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因的分子克隆及进化分析  12-14    2.3 液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白的拓扑结构及其特性  14-15    2.4 液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白的表达及其调控机制  15-16    2.5 液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白与植物的耐盐性  16-17  3 讨论与展望  17  4 本研究的目的和意义  17-20第二章 栽培大豆和滩涂野大豆及其杂交后代苗期耐盐性鉴定  20-28  1 材料与方法  21-22    1.1 植物材料  21    1.2 方法  21-22  2 结果与分析  22-26    2.1 NaCl胁迫对3大豆叶和根中K~+含量的影响  23    2.2 NaCl胁迫对3大豆叶和根中Na~+含量的影响  23-24    2.3 NaCl胁迫对3大豆叶和根中Cl~-含量的影响  24-25    2.4 大豆DNA提取及耐盐标记基因PCR扩增  25-26  3 讨论  26-28第三章 栽培大豆和滩涂野大豆及其杂交后代中NHX1基因的克隆及其功能的初步分析  28-52  1 材料与方法  29-40    1.1 材料  29-32    1.2 实验方法  32-40  2 结果与分析  40-49    2.1 半定量RT-PCR  40-42    2.2 亚细胞定位  42-46    2.3 NHX1基因的原核表达  46-49  3 讨论  49-52全文结论  52-54创新性  54-56存在问题与展望  56-58参考文献  58-64致谢  64

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 油料作物 > 大豆
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