学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

圆眼珍珠蛙（Lepidobatrachus laevis）皮肤cDNA文库的构建、筛选及胰蛋白酶抑制剂的原核表达和活性研究

作　者: 王玉伟
导　师: 高国富；赖仞
学　校: 南京农业大学
专　业: 动物学
关键词: 圆眼珍珠蛙 胰蛋白酶抑制剂 分子克隆 原核表达
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 2次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


两栖类是一类具有生态、科研、经济、以及文化价值的自然资源。地球上拥有丰富的两栖类动物资源,它们是生物资源的重要组成部分,也是人类的宝贵财富。两栖类动物被广泛运用于医药、食用及观赏等,其皮肤组织中含有大量复杂多样的生物活性物质,具有极高的科研价值和利用价值,是急待于开发的资源宝库。近年来,从两栖动物皮肤分泌液中发现了大量的结构新颖,功能独特的生物活性多肽,如蛋白酶抑制剂、抗菌肽、抗氧化肽以及凝集素等。其中两栖动物皮肤中以丝氨酸蛋白酶抑制剂占多数(根据蛋白酶活性位点的特异残基,蛋白酶抑制剂被分为四类：天冬氨酸蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂和半胱氨酸蛋白酶抑制剂)。以南美特有的圆眼珍珠蛙为研究对象,构建了其皮肤的cDNA文库,随机挑选丈库单菌落进行测序。筛选到两个候选基因Y1-2、Y3-34。再NCBI蛋白质数据库中进行BLAST比对,Y1-2蛋白质一级结构与胰蛋白酶抑制剂(Aedes aegypti)有44%的同源性,Y3-34与红细胞凝集素(Xenopus tropicalis)有53%的同源性。而且它们与同源蛋白的半胱氨酸位置和数量一致。我们利用大肠杆菌pET表达系统成功地对有Y1-2进行了表达,通过分子筛Sephadex G50和反向高压液相(RP-HPLC)纯化步骤,获得了具有胰蛋白酶抑制剂活性的表达蛋白。MALDI-TOF测定该表达产物分子量为6160.0273 Da,与理论预测相吻合。以发色底物B3133进行酶动力学反应,测定该蛋白的蛋白酶抑制常数Ki为16.5178μM。

全文目录


摘要  6-7ABSTRACT  7-8缩略词及对照表  8-9第一章 文献综述  9-21  1. 两栖动物皮肤活性多肽的研究进展  9-14    1.1 两栖动物皮肤的特点  9    1.2 两栖动物皮肤中活性多肽研究进展  9-14  2. 丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究进展  14-21    2.1 蛋白酶抑制剂的分类  14-15    2.2 丝氨酸蛋白酶抑制剂的分类与结构  15-18    2.3 丝氨酸蛋白酶抑制剂的功能与应用  18-21第二章 圆眼珍珠蛙皮肤cDNA文库的构建、随机筛选  21-29  1. 材料与方法  21-24    1.1 试验材料、试剂  21    1.2 圆眼珍珠蛙cDNA文库的构建  21-24    1.3 随机挑取单克隆测序  24    1.4 序列比对分析  24  2. 结果与分析  24-27    2.1 圆眼珍珠蛙RNA琼脂糖电泳  24-25    2.2 圆眼珍珠蛙cDNA双链琼脂糖电泳  25    2.3 cDNA文库构建结果  25    2.4 cDNA文库随机测序结果分析  25-27  3. 小结  27-29第三章 胰蛋白酶抑制剂Y1-2的原核表达和活性研究  29-47  1. 材料与方法  29-35    1.1 试验材料、试剂与仪器设备  29    1.2 胰蛋白酶抑制剂Y1-2表达载体的构建  29-33    1.3 融合表达菌株Y1-2+P+RT的诱导及目标蛋白的分离纯化  33-34    1.4 胰蛋白酶抑制剂活性活性检测  34-35  2. 结果与分析  35-45    2.1 Y1-2成熟肽的预测  35-36    2.2 Y1-2经过PCR加两端接头后的电泳图  36-37    2.3 pET-32a(+)酶切前后电泳图  37-39    2.4 IPTG表达菌株Y1-2+P+RT  39    2.5 融合蛋白亲和柱纯化、甲酸切割  39-40    2.6 G50分离纯化甲酸切割后样品  40-41    2.7 HPLC分离纯化G50活·性峰  41-43    2.8 测定蛋白分子量  43-44    2.9 Y1-2胰蛋白酶抑制剂的活性测定  44-45  3. 小结  45-47参考文献  47-53创新之处  53-54致谢  54-55附录  55-57

相似论文

  1. 拟南芥胱硫醚-γ-合成酶（D-AtCGS）基因在大肠杆菌中的表达及抗血清制备,Q943.2
  2. 南极冰藻GPx、GST和SAHH基因的克隆、定量分析及原核表达载体的构建,Q943.2
  3. 草鱼呼肠孤病毒vp5、vp7基因cDNA的克隆、表达及VP5、VP7蛋白亚细胞定位研究,S941.41
  4. 草鱼呼肠孤病毒vp6和ns38基因的克隆、表达及VP6和NS38免疫原性研究,S941.41
  5. 小麦黄花叶病毒（WYMV）RNA2编码基因的功能研究,S435.121
  6. 红笛鲷清道夫受体B型Ⅰ类和抗冻蛋白Ⅱ型基因的克隆、表达与定量分析,S917.4
  7. 羊种布鲁氏菌16M优势蛋白抗原的鉴定,S852.61
  8. 鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及S1、N基因的序列分析,S852.65
  9. 猪细小病毒河南流行株的分离、鉴定及部分生物学特性研究,S852.65
  10. 人源β-防御素-6的原核表达及纯化,Q78
  11. 新型菊酯类农药降解酶的生化鉴定及分子改造研究,X172
  12. 棉铃虫与烟夜蛾寄主选择机制的比较研究,S435.622.3
  13. RNA聚合酶Ⅱ介导的FCV反向遗传操作系统的建立及RHDV VP60基因的表达,S852.65
  14. 兔源支气管败血波氏杆菌PRN蛋白的表达及其免疫保护性研究,S855.12
  15. 兔支气管败血波氏杆菌fimN基因的克隆表达及快速检测方法的建立,S858.291
  16. 栽培大豆和滩涂野大豆及其杂交后代苗期耐盐性与NHX1基因功能的初步研究,S565.1
  17. 莜麦中α-淀粉酶抑制剂的分离纯化与性质研究,S512.6
  18. 新疆沙冬青（Ammopiptanthus nanus）抗寒相关基因的分子克隆及表达分析,S793.9
  19. 截短型rBTI的表达、纯化及性质研究,R284.1
  20. 草鱼NCCRP-1和IL-10基因的克隆和表达,S917.4

中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
© 2012 www.xueweilunwen.com